اقدامات احتیاطی برای استفاده از لوله اولتراfiltration

(1) لوله فوق تصفیه مناسب را انتخاب کنید. به طور کلی وزن مولکولی که باید حفظ شود نباید بیشتر از ۱ / ۳ وزن مولکولی پروتئین هدف باشد. به عنوان مثال اگر وزن مولکولی پروتئین هدف ۳۵kDa باشد می توان لوله اولتراfiltration با وزن مولکولی ۱۰kDa را انتخاب کرد. اگر وزن مولکولی پروتئین هدف حدود ۱۰kd باشد، می توان از یک لوله اولتراfiltration با وزن مولکولی ۳KD استفاده کرد. کتابچه راهنمای آموزش را با دقت بخوانید و به تحمل مختلف غشای اولتراfiltration به مواد شیمیایی مختلف توجه کنید.

(2) اولتراfiltration تازه خریداری شده خشک است. اضافه کردن آب فوق العاده پور قبل از استفاده، و آب به طور کامل از غشا عبور خواهد کرد. قبل از خنک کردن آن را در حمام یخ و یا یخچال برای چند دقیقه. سپس آب را بریزید و محلول پروتئین را به آن اضافه کنید. مقدار اضافه شده نباید از خط سفید بالای لوله تجاوز کند. عمليات بايد سبک باشه . قبل از اضافه کردن محلول پروتئین، لوله اولتراfiltration نیاز به قرار دادن بر روی یخ برای پیش سرد شدن دارد.

(3) تعادل. هم جرم و هم مرکز گرانش باید متعادل باشد. توجه داشته باشید که سرعت و شتاب نباید خیلی سریع باشد، در غیر این صورت غشای اولتراfiltration به طور مستقیم آسیب خواهد دید. اولترافیلمراتاسیون مرکز (پیش کولینگ سنتریفیوژ تا ۴ درجه) را شروع کنید. پس از تبدیل RPM از سنتریفیوژهای مختلف به G، متفاوت است. شتاب سنتریفیوژ را به پایین ترین دنده تنظیم کنید تا فشار روی غشا کاهش یابد. توجه داشته باشید که قبل از خروج از مرکز، باید صبر کنید تا سنترریفیوژ به سرعت هدف برسد، در غیر این صورت وقتی مشکلی با سنتریفیوژ وجود دارد، در اولین بار نمی توانید با آن کنار آیید. جهت غشا و شفت چرخان باید بر اساس دستورالعمل تنظیم شود (در مورد زاویه چرخان سنتریفیوژ، غشا عمود بر شفت است). در استفاده عملی، سرعت به طور کلی پایین تر از آن در کتابچه راهنمای کاربر است که می تواند عمر خدمات لوله centrifugal را طولانی تر کند.

(4) هنگامی که آن را به 1ml باقی مانده متمرکز شده است، محلول بافر 50ul و اضافه کردن 10ul به جریان را از طریق ببینید که آیا آن را آبی می شود، به طوری که به قضاوت در مورد اینکه آیا لوله ultrafiltration نشت پروتئین. اگر لوله نشت, ریختن لایه فوقانی و جریان را از طریق لوله جدید و شروع ultrafiltration. برای قضاوت دقیق در مورد اینکه آیا لوله در حال نشت است، سانتریفوژ با BSA 5mgml به مدت 10min، سپس جریان را از طریق، اجرای چسب پروتئین و یا برادفورد برای اندازه گیری خشن، و همچنان به اضافه کردن راه حل پروتئین باقی مانده برای تمرکز (عمل بر روی یخ برای جلوگیری از پروتئین از گرم شدن) تا زمانی که تمام راه حل های متمرکز اضافه شده است. توجه کنید که آیا بارش پروتئین در طول سنتریفیوژ رخ می دهد یا نه و در نتیجه انسداد لوله به وجود می آورد. اگر بارش رخ داد، علت خاص بارش را تعیین کنید، آیا غلظت پروتئین بیش از حد بالا است یا بافر نامناسب است؛ اولی را می توان با اولتراfiltration همزمان با لوله های اولترافیلمراتاسیون متعدد حل کرد تا غلظت کاهش پیدا کند. دومی تغییر راه حل های بافر مختلف تا زمانی که پروتئین بارش نمی کند.

(5) مراحل قبلی برای تمرکز پروتئین استفاده می شود. اگر می خواهید بافر را تغییر دهید، هنگامی که محلول پروتئین کل به حدود 1ml متمرکز می شود، به آرامی یک بافر جدید (اولتراfiltration از طریق غشای اولتراfiltration 0.22um) اضافه کنید، و سپس به حدود 1ml برای سه بار متوالی تمرکز کنید. حجم نهایی آخرین غلظت بستگی به غلظت پروتئین مورد نیاز دارد که به طور کلی بیش از ۵۰۰ul نیست، یا می توان آن را تا کمتر از ۲۰۰ul متمرکز کرد. با توجه به غلظت حجم حداقل ۱۰ بار در هر بار، می تواند سه بار به بیش از ۱۰ بار برسد که اساساً می تواند به هدف تغییر بافر دست یابد.