بحث مختصر در مورد چندین روش منحصر به فرد فیبر توخالی در خالص سازی بدنه

اجسام گنجانده شده (IB) ذرات پروتئینی با چگالی بالا و نامحلول هستند که در غشاها پیچیده شده اند و زمانی که ژن های خارجی در سلول های پروکاریوتی، به ویژه در اشریشیا کلی بیان می شوند، تشکیل می شوند. هنگامی که زیر میکروسکوپ مشاهده می شود، IB یک ناحیه با انکسار بالا است که به وضوح با سایر اجزای سیتوپلاسم متفاوت است.

تشکیل بدن انکلوزیون نسبتاً پیچیده است، مربوط به سرعت تولید پروتئین در سیتوپلاسم است، غلظت پپتیدهای تازه تولید شده زیاد است و زمان کافی برای تا شدن وجود ندارد تا دانه های پروتئینی آمورف تشکیل شود. اجسام انکلوژن اساساً از پروتئین‌هایی تشکیل شده‌اند که بیش از 50 درصد آن‌ها محصولات شبیه‌سازی شده هستند. ساختار اولیه این محصولات کاملاً صحیح است، اما پیکربندی سه بعدی اشتباه است، بنابراین فعالیت بیولوژیکی وجود ندارد. اندازه بدن شامل 0.{3}} میکرومتر، نامحلول در آب، تنها در مواد دناتوره‌کننده مانند اوره، گوانیدین هیدروکلراید و غیره محلول است.

در E. coli، اجسام انکلوژن می توانند در دو مکان سلول ایجاد شوند: سیتوپلاسم و سیتوپلاسم محیطی. مکان و خصوصیات اجسام انکلوژن در سلول به نحوه بیان پروتئین ها بستگی دارد.

قطر حشرات موجود در سیتوپلاسم E. coli معمولاً بین {0}}}.2 تا 1.5 میکرومتر است و پروتئین های مختلف دارای قطرهای متفاوتی هستند، مانند اندازه اینترفرون 0.811 میکرومتر و اندازه prorennet 1.281μm است. در برخی موارد، قطر برخی از اجسام آخال بزرگتر از قطر E.coli است که باعث برآمدگی E. coli می شود. به طور کلی، یک سلول تنها دارای یک جسم شامل است.

 

تصفیه بدن شامل

 

فرآیند تصفیه بدن شامل موارد زیر است:

خرد کردن سلول:

فن آوری کلی خرد کردن سلولی عبارت است از: خرد کردن بافت با سرعت بالا، همگن سازی هموژنایزر شیشه، درمان اولتراسونیک، روش انجماد و ذوب مکرر، عملیات شیمیایی (به طور کلی با استفاده از درمان لیزوزیم).

 

شستشوی بدن شامل:

اجسام گنجاننده ذرات جامد غیرفعال هستند که از آگلوتیناسیون درون سلولی پروتئین های بیان شده توسط باکتری ها تشکیل می شوند که معمولاً به شکل آمورف و نامحلول وجود دارند. در بدن انکلوژن، پروتئین هدف واقعی فقط حدود 50٪ را تشکیل می دهد و بقیه حاوی لیپیدها، لیپوپلی ساکاریدها، اسیدهای نوکلئیک و هتروپروتئین ها هستند که به بدن انکلوژن متصل می شوند و بر بازسازی مجدد پروتئین بدن انکلوژن تأثیر می گذارند. بنابراین، شستشو قبل از دناتوره شدن یک مرحله بسیار ضروری است.

بعلاوه، شستن بدنه های انکلوژن برای افزایش بازده تاخوردگی مجدد پروتئین های نوترکیب مفید است. با حذف ناخالصی‌ها، می‌توان موانع موجود در فرآیند بازسازی را کاهش داد، به‌طوری‌که پروتئین را می‌توان با کارآمدتری تا و به‌درستی جمع‌آوری کرد و در نتیجه فعالیت و عملکرد پروتئین را بهبود بخشید.

شستشو معمولاً از کمتر از 1٪ از مواد شوینده خنثی استفاده می شود، مانند Tween، Triton، اوره و NP40 به علاوه EDTA و مواد کاهنده 2-mercaptotreitol (DTT)، - مرکاپتواتانول بارها تکرار می شود، زیرا ظرفیت شستشوی مواد شوینده با افزایش می یابد. با افزایش قدرت یونی محلول، می توان در شستشوی اجسام انکلوزیون، نمک طعام را برای افزایش قدرت یونی

اجسام گنجانده شده را می توان برای حذف سایر اجزای محلول تجزیه سلولی با سانتریفیوژ یا فیلتراسیون استفاده کرد که هر دو از خواص فیزیکی متفاوت اجسام انکلوژن بهره می برند.

 

سانتریفیوژ:

پروتئین های بدن انکلوژن بسیار متراکم تر از همان حجم قطعات سلولی هستند، بنابراین بدن انکلوزیون را می توان با استفاده از سانتریفیوژ از بقیه سلول جدا کرد. سانتریفیوژ مداوم پرکاربردترین عملیات برای به دست آوردن اجسام آخال در تولید صنعتی است. از آنجایی که چگالی قطعات سلولی کوچکتر از چگالی جسم انکلوزیون است، سرعت رسوبگذاری کمتر از جسم انکلوزیون است. تعلیق و سانتریفیوژ مداوم می تواند بیشتر بدنه را سانتریفیوژ کند، در حالی که قطعات سلولی به تدریج حذف می شوند.
فیلتراسیون (فیلتراسیون جریان مماسی): با توجه به اندازه‌های مولکولی مختلف اجسام گنجانده شده و پروتئین‌های محلول، می‌توان از روش فیلتراسیون استفاده کرد که می‌تواند هزینه‌های عملیاتی را کاهش دهد و مقیاس آن را آسان کند. فیلتراسیون جریان مماسی (TFF) توسط اختلاف فشار غشایی هدایت می شود. مواد و ناخالصی های کوچکتر از اندازه منافذ غشا از غشا عبور می کنند، در حالی که ناخالصی هایی مانند سلول هایی با ذرات بزرگتر به دام می افتند. دیافراگم غشایی که عموماً برای شستشوی فیلتر استفاده می شود 0.1μm است. میکروفیلتراسیون جریان مماسی فیبر توخالی می تواند به طور مستقیم با محتوای جامد بالای مواد مایع، مراحل کمتر، عملیات ساده مقابله کند، غشاء را می توان به طور مکرر از طریق تمیز کردن، کاهش سرمایه گذاری تجهیزات و هزینه های عملیاتی، مطابق با الزامات تولید خودکار مدولار استفاده کرد.

 

مورد زیر یک مورد کاربردی برای شستشوی بدنه با استفاده از ستون های فیبر توخالی Guidling است.

ما از فیبر توخالی 94cm2 0.1-0.45μm برای تغلیظ 250mL مایع (وزن مولکولی پروتئین هدف 17kd) استفاده کردیم. در کل فرآیند شستشو، میزان بازیابی پروتئین هدف و کاهش شار غشایی مورد بررسی قرار گرفت.

0-71دقیقه فرآیند غلظت است، 71-224دقیقه فرآیند شستشو و فیلتراسیون است. در طول کل فرآیند میکروفیلتراسیون، TMP به تدریج افزایش یافت، سرعت ورودی مایع بدون تغییر باقی ماند و میانگین شار مواد 12LMH بود.

نتایج نشان داد که پروتئین هدف به طور کامل به دام افتاده بود و میزان بازیابی پروتئین هدف بیش از 90 درصد بود. ستون های فیبر توخالی هدایت کننده پایدار و برای این کاربرد مناسب هستند.

 

انحلال بدن شامل:

اجسام انکلوزیون عموماً تحت شرایط عامل دناتوره‌کننده اوره یا گوانیدین هیدروکلراید حل می‌شوند و پروتئین‌های بدنه محلول کاملاً دناتوره می‌شوند، یعنی به جز حفظ ساختار اولیه و پیوندهای کووالانسی، همه پیوندهای هیدروژنی و پیوندهای آبگریز از بین می‌روند و آبگریز هستند. زنجیره های جانبی کاملاً در معرض دید قرار می گیرند.

اوره و گوانیدین هیدروکلراید دناتوره کننده هایی با قدرت متوسط ​​هستند که به راحتی با دیالیز و اولترافیلتراسیون حذف می شوند. غلظت کلی اوره 8-10M، گوانیدین هیدروکلراید 6-8M. انحلال اوره دارای مزایای عدم یونیزاسیون، خنثی، کم هزینه است، حذف پروتئین پس از تبدیل مجدد باعث رسوب پروتئین زیادی نمی شود و اجسام آخالی محلول را می توان با انواع روش های کروماتوگرافی خالص کرد، بنابراین به طور گسترده ای مورد استفاده قرار گرفته است. .

 

تاکردن مجدد پروتئین بدن:

پروتئین نوترکیب محلول باید به درستی تا شود تا یک پروتئین عملکردی تشکیل شود. تکنیک‌های تغییر طبیعت عبارتند از رقیق‌سازی محلول پروتئین تا نزدیک به خنثی، حذف دناتورانت، تغییر طبیعت روی ستون و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل. در این میان، رقیق کردن محلول پروتئین به حالت تقریباً خنثی و حذف دناتورانت از روش‌های کلاسیک متداول برای احیای طبیعی است، به‌ویژه روش رقت‌سازی مجدد بیشترین میزان استفاده را دارد.

حذف دناتوره:

دیالیز: مزیت آن این است که حجم افزایش نمی یابد و سرعت حذف دناتورانت با کاهش تدریجی غلظت مایع نفوذ پذیر خارجی کنترل می شود، اما زمان زیادی طول می کشد و به راحتی تشکیل توده های پروتئینی غیرفعال می شود که برای آن مناسب نیست. عملیات در مقیاس بزرگ است و نمی تواند در مقیاس تولید اعمال شود.

اولترافیلتراسیون (TFF): به راحتی می توان سرعت دیالیز را کنترل کرد، چه در تحقیق و توسعه، آزمایش آزمایشی یا تولید، می تواند دناتوره ها (تغییر مایع + غلظت) را از طریق اولترافیلتراسیون (TFF) حذف کند.

 

خالص سازی پروتئین بدن شامل:

روش‌های خالص‌سازی پروتئین پس از تبدیل مجدد مشابه روش‌های خالص‌سازی پروتئین محلول است، یعنی کروماتوگرافی تبادل یونی، کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون، کروماتوگرافی میل ترکیبی، رسوب نمک سولفات آمونیوم و غیره.

اجسام انکلوژن هیچ فعالیت بیولوژیکی ندارند، نیازی به نگرانی در مورد از دست دادن فعالیت پروتئین نیست و مقادیر زیاد بیان منجر به مرگ سلولی نمی شود و مقاومت در برابر حمله پروتئاز را به حداکثر می رساند. فیبر توخالی Jiuling را می توان به طور انعطاف پذیر در فرآیند تصفیه پایین دست بدنه های گنجاندن استفاده کرد. در مرحله شستشوی بدنه، عملکرد عالی در مقایسه با شستشوی گریز از مرکز، استفاده از فیبر توخالی میکروفیلتراسیون با تکنولوژی نه سن برای شستشوی فیلتراسیون جریان مماسی می تواند زمان فرآیند را تا حد زیادی کوتاه کند و نرخ بازیابی کلی می تواند به بیش از 90٪ برسد. فیبر توخالی Jiuling همچنین می تواند در مرحله بازسازی پروتئین در بدن های انکلوژن استفاده شود. کدورت مایع خوراک فیلتر شده توسط فیبر توخالی میکروفیلتراسیون به میزان قابل توجهی کاهش می یابد و نرخ بازیابی پروتئین بالا است. استفاده از الیاف توخالی اولترافیلتراسیون نه تنها می تواند دناتوره ها را حذف کند، بلکه زمان بارگذاری نمونه کروماتوگرافی را نیز کوتاه می کند تا در زمان صرفه جویی شود، حجم پرکننده کاهش یابد و هزینه تولید کاهش یابد. نرخ بازیابی فیبر توخالی میکروفیلتراسیون/ اولترافیلتراسیون با مواد مختلف متفاوت است و نرخ بازیابی کلی می تواند به 90-95٪ برسد.

Guidling Technology از شما برای درخواست کیت های تست برای بررسی های مرتبط استقبال می کند.

 

درباره هدایت

Guidling Technology یک شرکت ملی با فناوری پیشرفته است که بر روی بیوداروها، کشت سلولی، تصفیه و غلظت زیست پزشکی، تشخیص و مایعات صنعتی تمرکز دارد. ما دستگاه‌های فیلتر گریز از مرکز، کاست‌های اولترافیلتراسیون و میکروفیلتراسیون، فیلتر ویروس، سیستم TFF، فیلتر عمق، فیبر توخالی و غیره را با موفقیت توسعه داده‌ایم. غشاها و فیلترهای غشایی ما به طور گسترده در غلظت، استخراج و جداسازی پیش فیلتراسیون، میکروفیلتراسیون، اولترافیلتراسیون و نانوفیلتراسیون استفاده می شوند. خطوط تولید متعدد ما، از فیلتراسیون آزمایشگاهی کوچک و یکبار مصرف گرفته تا سیستم های فیلتراسیون تولید، آزمایش عقیم سازی، تخمیر، کشت سلولی و موارد دیگر، نیازهای آزمایش و تولید را برآورده می کند. Guidling Technology مشتاقانه منتظر همکاری با شما است!