اصول اولیه و گردش کار سنتز پپتید فاز جامد-(SPPS)

سنتز پپتید فاز جامد (SPPS)روشی برای سنتز پپتیدها بر روی یک تکیه گاه جامد است. استراتژی های اصلی SPPS شاملروش Bocوروش Fmoc. سنتز پپتید یک فرآیند تکراری از افزودن اسید آمینه متوالی است و به طور کلی ازC-پایانه (انتهای کربوکسیل)بهN-پایانه (انتهای آمینه). ابتدا گروه کربوکسیل اولین اسید آمینه پپتید هدف به صورت کووالانسی به یک تکیه گاه جامد (رزین) متصل می شود. با استفاده از گروه آمینه این اسید آمینه به عنوان نقطه شروع، گروه محافظ نهایی N- حذف می‌شود و زنجیره پپتیدی در حال رشد در اثر واکنش با بیش از یک اسید آمینه دوم فعال طولانی می‌شود. این چرخه{4}}جفت → شستشو → محافظت زدایی → خنثی سازی و شستشو → کوپلینگ بعدی-تکرار می‌شود تا طول پپتید مورد نظر به دست آید. در نهایت، زنجیره پپتیدی از رزین جدا می شود و برای به دست آوردن پپتید هدف خالص می شود. هنگامی که گروه آمینو - باBoc (ترت-بوتیلوکسی کربونیل)، روش به عنوان نامیده می شودسنتز پپتید فاز جامد-بر پایه Boc. هنگامی که گروه آمینو - باFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl)، معروف استسنتز پپتید فاز جامد-بر اساس Fmoc.

 

سنتز پپتید فاز جامد-بر پایه Boc{1} (روش Boc)

درروش Boc, گروه های Boc قابل حذف توسط تری فلورواستیک اسید (TFA)برای محافظت از گروه‌های آمینه - استفاده می‌شوند، در حالی کهگروه‌های محافظ نوع{0}}بنزیلبرای زنجیره های جانبی استفاده می شود. در طول سنتز، ابتدا یک اسید آمینه-حفاظت شده با Boc به صورت کووالانسی به رزین متصل می‌شود. سپس گروه Boc با TFA حذف می شود و انتهای آمینه آزاد حاصل با تری اتیلامین خنثی می شود. اسید آمینه بعدی با استفاده از آن فعال می شودDCC (دی سیکلوهگزیل کاربودیمید)و برای گسترش زنجیره پپتیدی جفت می شود. پس از اتمام مونتاژ، پپتید هدف با استفاده از یک اسید قوی معمولاً از رزین جدا می شود.هیدروژن فلوراید بی آب (HF)یااسید تری فلورومتان سولفونیک (TFMSA)در روش سنتز Boc، تیمارهای اسیدی مکرر برای حذف گروه های محافظ قبل از هر مرحله کوپلینگ مورد نیاز است. این می تواند منجر به چندین واکنش جانبی، مانند جدا شدن زودهنگام پپتید از رزین و ناپایداری زنجیره های جانبی اسید آمینه در شرایط اسیدی شود که منجر به واکنش های جانبی نامطلوب می شود.

 

سنتز پپتید فاز جامد-بر اساس Fmoc{1} (روش Fmoc)

در1978, مینهوفر و آترتونبا استفاده از یک استراتژی سنتز پپتیدFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl)به عنوان -گروه محافظ آمینو، معروف بهروش Fmoc. در این رویکرد، گروه -آمینو با محافظت می شودپایه-Fmoc ناپایدار، در حالی که زنجیره های جانبی با محافظت می شوندگروه‌های محافظ از نوع اسید-ناپذیر Boc-مزیت اصلی Fmoc به عنوان یک گروه محافظت کننده آمینو-در آن استپایداری در شرایط اسیدی; درمان با معرف هایی مانندتری فلورواستیک اسید (TFA)و می توان انتخابی با استفاده ازپایه ملایم. در عین حال، گروه‌های محافظ زنجیره جانبی مانند Boc در شرایط اولیه پایدار هستند و تحت تیمار اسیدی حذف می‌شوند. در نهایت، پپتید به طور کمی از رزین جدا می‌شود.TFA/دی کلرومتان (DCM)اجتناب از استفاده از اسیدهای قوی و در نتیجه بهبود ایمنی و سازگاری با سنتز معمول پپتید.

 

تاریخچه توسعه سنتز پپتید فاز جامد-(SPPS)

1. مرحله بنیادی (اوایل قرن 20 تا 1963)

در1902, امیل فیشراولین کسی بود که سنتز پپتید را کشف کرد، اما به دلیل محدودیت‌های فنی پیشرفت کند بود. سنتزهای اولیه استفاده شدهگروه های محافظ بنزوئیل و استیل، که به سختی حذف می شد و اغلب منجر بهشکست زنجیره پپتیدی.

در1932, ماکس برگمانو همکاران{0}} را معرفی کردندگروه بنزیلوکسی کربونیل (Z).به عنوان یک -گروه محافظ آمینو. این گروه را می توان در زیر حذف کردهیدروژناسیون کاتالیزوری یا شرایط اسیدی، ارائه ابزار قابل اعتمادتری برای سنتز پپتید و پایه گذاری برای توسعه سنتز پپتید فاز جامد در دهه 1960.

در طول1950s، دانشمندان با موفقیت انواع مختلفی را سنتز کردندپپتیدهای فعال بیولوژیکی، ماننداکسی توسین و انسولین. این دستاوردها شیمی پپتید را بیشتر کرد و زمینه را برای ظهور سنتز پپتید فاز جامد- ایجاد کرد.

 

2. مرحله پیشگام (1963)

در1963, رابرت بی مریفیلدپیشنهاد کردروش سنتز پپتید فاز جامد (SPPS).، که در آنC{0}}اسید آمینه پایانیبه یک تکیه گاه رزین متصل می شود و زنجیره پپتیدی از طریق چرخه های مکرر طویل می شود.حفاظت و جفت شدن. این رویکرد تا حد زیادی فرآیند سنتز پپتید را ساده کرد و تبدیل به آن شدروش ترجیحیبرای مونتاژ پپتید

مریفیلد استفاده کردBoc (ترت-بوتیلوکسی کربونیل)برای محافظت از گروه آمینو -. در اواخر دهه 1960، او همچنین توسعه داداولین سنتز کننده پپتید کاملاً خودکارو با موفقیت سنتز شدپروتئین های بیولوژیکیمانندریبونوکلئاز (124 اسید آمینه). برای این دستاوردهای پیشگامانه، مریفیلد جایزه دریافت کردجایزه نوبل شیمی در سال 1984.

 

3. مرحله نوآوری فناوری (1972)

در1972, لو کارپینورا توسعه دادگروه محافظ 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc).، که می تواند باشدبه آرامی تحت شرایط اولیه حذف می شود، کاهش واکنش های جانبی. این امر آن را به ویژه برایپپتیدهای پیچیدهوسنتز خودکار.

راروش Fmocبه تدریج جایگزین روش Boc به عنوان استراتژی اصلی شد. سنتز کننده های پپتید خودکار بر اساس هر دوشیمی Fmoc و Bocمتعاقباً توسعه یافتند و باعث شدنداتوماسیون سنتز پپتیدو کارایی و تکرارپذیری را تا حد زیادی بهبود می بخشد.

 

4. مرحله بلوغ و گسترش (دهه 1990 تا کنون)

بهینه سازی رزین و معرف:توسعه ازرزین‌های اصلاح‌شده-هیدروفیل PEG-با بارگیری بالاو معرف های کوپلینگ کارآمد مانندHBTUوHATUبه طور قابل توجهی کارایی و بازده سنتز پپتید فاز جامد (SPPS) را بهبود بخشیده است.

یکپارچه سازی تکنولوژیک:رویکردهای جدید مانندسنتز به کمک مایکروویو-وشیمی جریانزمان واکنش را کوتاه کرده و بازده را بیشتر افزایش داده اند.

 

اصول اولیه و گردش کار SPPS:
اصل اصلی سنتز پپتید{0}}فاز جامد این استساخت گام به گام یک زنجیره پپتیدی روی یک تکیه گاه جامد، با استفاده ازحفاظت از استراتژی های گروهوواکنش های تراکم (جفت شدن).برای رسیدن بهمونتاژ پپتید کارآمد و قابل کنترل.

1. نقش تکیه گاه جامد (رزین) در سنتز پپتید فاز جامد-(SPPS)

A رزین پلیمری نامحلول-مانندپلی استایرن-دیوینیل بنزن متقاطع-رزین، رزین وانگ یا رزین آمید رینک-به عنوان پشتیبان ثابت در SPPS انتخاب شده است. سطح رزین شاملگروه های عملکردی(مثلاً گروه های هیدروکسیل یا آمینو) که می توانند تشکیل شوندپیوندهای کووالانسی با یک سر زنجیره پپتیدی، معمولا-پایانه، پپتید را به تکیه گاه جامد متصل می کند. این اتصال کووالانسی تضمین می کند که پپتید در حال رشددر طول سنتز به رزین متصل می ماند، که تا حد زیادیمراحل واکنش بعدی، شستشو و تصفیه را تسهیل می کند

 

2. حفاظت از استراتژی گروه در سنتز پپتید فاز جامد (SPPS)

در طول سنتز پپتید،گروه‌های عاملی -آمینو، گروه کربوکسیل، و زنجیره جانبی فعال-اسیدهای آمینه (مانند تیول، کربوکسیل و گروه های آمینه) مستعد ابتلا بهواکنش های جانبی. برای جلوگیری از این واکنش های نامطلوب،گروه های حفاظتیاستفاده می شوند. گروه های حفاظتی رایج عبارتند از:-گروه‌های محافظت آمینو:

Boc (ترت-بوتیلوکسی کربونیل):اسید-ناپایدار، به راحتی از زیر جدا می شودشرایط اسیدی.

Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl):پایدار در شرایط اسیدی، می تواند در زیر حذف شودشرایط اولیه(مثلاً محلول پیپریدین/DMF).گروه‌های حفاظت از زنجیره جانبی-انتخاب شده با توجه به خواص شیمیایی زنجیره جانبی اسید آمینه.گروه های مشترک شاملبنزیل (Bn)، ترت-بوتیل (tBu)، تری‌تیل (Trt)و غیره این گروه ها هستنددر پایان سنتز حذف می شودمعمولاً در حین جداسازی پپتید از رزین، با استفاده ازاسید یا سایر شرایط خاص.

 

3.C-Terminus to N-Terminus Synthesis در SPPS

درسنتز پپتید فاز جامد-(SPPS)، مونتاژ پپتید معمولاً از ساعت شروع می شودC-پایانه (انتهای کربوکسیل)و گام به گام به سمتN-پایانه (انتهای آمینه). این به این دلیل است کهC{0}}اسید آمینه پایانی ابتدا به تکیه گاه جامد متصل می شود، و اسیدهای آمینه بعدی به جفت می شوندگروه آمینه آزاد زنجیره پپتیدی که قبلاً به رزین متصل شده است، به تدریج زنجیره پپتیدی طولانی می شود.

 

4. واکنش جفت شدن در فاز جامد{{1} سنتز پپتید (SPPS)

اسیدهای آمینه محافظت شده باید باشندفعال شدبه طوری که آنهاگروه های کربوکسیل واکنش پذیر می شوند، به آنها اجازه می دهد تا a را تشکیل دهندپیوند پپتیدیبا گروه آمینه پپتید متصل به رزین-. مشترکمعرف های فعال کنندهشامل شودکربودییمیدها(به عنوان مثال، DCC، DIC)،HOBt, HATU، وPyBOP. پس از فعال شدن، گروه کربوکسیل با گروه آمینه آزاد در a واکنش می دهدواکنش تراکم، تشکیل یکپیوند آمیدیو در نتیجه اسید آمینه جدید را به زنجیره پپتیدی در حال رشد متصل می کند.

 

5. عملیات تکراری (دوره ای) در سنتز پپتید فاز جامد (SPPS)

فرآیند شاملتکرار چرخه محافظت → جفت → شستشو، اضافه کردنیک اسید آمینه در هر چرخهتا به تدریج زنجیره پپتیدی طولانی شود. بعد از هر کدامواکنش جفت شدن، رزین استشسته شده(به عنوان مثال، با حلال هایی مانند DMF یا DCM) برای حذف معرف های واکنش نداده، محصولات و اسیدهای آمینه اضافی. راسپس -گروه آمینو باقیمانده تازه اضافه شده حذف می‌شود، افشای یک آمین آزاد برای آماده شدن برای واکنش جفت شدن بعدی. این چرخه تا زمانی که توالی پپتیدی مورد نظر به طور کامل جمع شود تکرار می شود.

 

6. برش در فاز جامد-سنتز پپتید (SPPS)

هنگامی که زنجیره پپتیدی به طول مورد نظر رسید، آن استاز تکیه گاه جامد جدا شده استبا استفاده از یک معرف مناسب، در حالی که به طور همزمانحذف تمام گروه های محافظ. یک معرف برش متداول استتری فلورواستیک اسید (TFA)، که نه تنهاپیوند بین پپتید و رزین را می شکندبلکه همچنینگروه های محافظ را حذف می کندمانند Fmoc و Boc، بازگرداندن پپتید به آنایالت بومی. هنگامی که زنجیره پپتیدی به طول مورد نظر رسید، آن استاز تکیه گاه جامد جدا شده استبا استفاده از یک معرف مناسب، در حالی که به طور همزمانحذف تمام گروه های محافظ. یک معرف برش متداول استتری فلورواستیک اسید (TFA)، که نه تنهاپیوند بین پپتید و رزین را می شکندبلکه همچنینگروه های محافظ را حذف می کندمانند Fmoc و Boc، بازگرداندن پپتید به آنایالت بومی.

از طریق این مراحل،سنتز پپتید فاز جامد-(SPPS)را قادر می سازدمونتاژ کارآمد و کنترل شده زنجیره های پپتیدی روی یک تکیه گاه جامداجتناب از مراحل پیچیده تصفیه میانی مورد نیاز در سنتز فاز محلول سنتی-و بطور قابل توجهیبهبود راندمان سنتز و بازده.

از طریق این مراحل،سنتز پپتید فاز جامد-(SPPS)را قادر می سازدمونتاژ کارآمد و کنترل شده زنجیره های پپتیدی روی یک تکیه گاه جامداجتناب از مراحل پیچیده تصفیه میانی مورد نیاز در سنتز فاز محلول سنتی-و بطور قابل توجهیبهبود راندمان سنتز و بازده.