بررسی فرآیند شفاف سازی لیزات تخمیر با چگالی بالا اشریشیا کلی نوترکیب

 

به منظور کاهش تداخل مایع ماده در کروماتوگرافی و بهبود بازیابی پروتئین هدف، فرآیند شفاف سازی لیز تخمیر با چگالی بالا دو سویه اشریشیا کلی نوترکیب مورد مطالعه قرار گرفت. سویه‌های BL21-HP1036 و BL21-palA بیان‌کننده ژن‌های کلیدی Streptococcus suis و Haemophilus parasuis انتخاب شدند. فرآیند جریان مماسی، فرآیند سانتریفیوژ با سرعت بالا و فرآیند شفاف سازی کاست غشایی برای ارزیابی عملکرد پروتئین با کدورت و تشخیص الکتروفورز استفاده شد.

 

نتایج نشان داد که لیزات تخمیر با چگالی بالا BL21-HP1036، BL{21-palA بیان‌کننده ژن‌های کلیدی Streptococcus suis و Haemophilus parasuis با فیلتراسیون کاست غشایی و سانتریفیوژ شفاف شدند و بازده پروتئین بیش از 80% بود. که می تواند به طور موثر تداخل کروماتوگرافی را کاهش دهد و نرخ بازیابی را بهبود بخشد.

 

مقدمه

در حال حاضر، Streptococcus suis (SS) و Haemophilus parasuis (HPS) شایع ترین پاتوژن های بیماری های باکتریایی در مزارع خوک هستند که خسارات زیادی به صنعت خوک وارد می کنند. SS را می توان در مجموع به 35 سروتیپ 1-34 و 1/2 تقسیم کرد، و HPS را می توان به سروتیپ های 1-15 تقسیم کرد، و این دو اغلب با هم مخلوط می شوند و عمدتا باعث پلی سروزیت خوکی، آرتریت، مننژیت، اندوکاردیت می شوند. ، سپتی سمی باکتریایی و برونشیت.

 

با توجه به تعداد زیاد سروتیپ های Streptococcus suis و Haemophilus parasuis، حفاظت متقاطع بین سروتیپ های مختلف ضعیف است و در صورت درمان با آنتی بیوتیک، مقاومت آنتی بیوتیکی به طور قابل توجهی افزایش می یابد که بر اثر درمانی تأثیر می گذارد.

 

واکسن ها به یکی از ابزارهای موثر برای جلوگیری از SS و HPS تبدیل شده اند. واکسن‌های غیرفعال، واکسن‌های ضعیف، واکسن‌های زنده، واکسن‌های زیرواحد و واکسن‌های مهندسی ژنتیکی وجود دارد، اما واکسن‌های غیرفعال و واکسن‌های ضعیف شده عمدتاً در بازار هستند و محافظت ایمنی آنها خوب است، اما محافظت متقاطع مشخص نیست. واکسن ساب واحد نوع جدیدی از واکسن علیه استرپتوکوک سوئیس است که نوع جدیدی از واکسن با محافظت متقاطع قوی و قیمت پایین است. تحقیق و توسعه واکسن‌های زیرواحد استرپتوکوک سوئیس و هموفیلوس پاراسوئیس راه‌حلی عالی برای مشکلات پیشگیری و کنترل استرپتوکوکوس سوئیس و هموفیلوس پاراسوئیس که صنعت خوک در چین را آزار می‌دهند، ارائه می‌کند.

 

واکسن‌های استرپتوکوک سوئیس و زیرواحد هموفیلوس پاراسوئیس در معرض تخمیر با چگالی بالا توسط اشریشیا کلی نوترکیب قرار می‌گیرند. شفاف‌سازی لیز تأثیر زیادی بر بازده پروتئین‌های هدف دارد، اما گزارش‌های مرتبط کمی وجود دارد. چگونگی تحقق مرحله شفاف سازی فرآیند تخمیر و خالص سازی کار مهمی است. در این مقاله، E. coli نوترکیب BL21-HP1036، BL21-palA تخمیر با چگالی بالا به عنوان هدف، برای مطالعه چگونگی کاهش موثر کدورت محلول شفاف‌کننده، بهبود عملکرد پروتئین، فرآیند تخمیر واکسن زیرواحد استرپتوکوک سوئیس برای دستیابی به فناوری خرد کردن و شفاف سازی صنعتی برای ارائه مبنای نظری و پشتیبانی فنی.

 

1. مواد و روش ها

1.1 مواد

 

1.1.1 سویه ها

سویه های Streptococcus suis و Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 رسانه ها و معرف های اصلی

عصاره مخمر و خوک دریایی؛ کلرید سدیم؛ کانامایسین، IPTG؛ فرمالدئید از; کیت ژل SDS-PAGE.

 

1.1.3 تجهیزات آزمایش اصلی

تخمیر با چگالی بالا؛ سانتریفیوژ با سرعت بالا؛ دستگاه الکتروفورز; سیستم تصویربرداری ژل ماوراء بنفش؛ سنگ شکن التراسونیک؛ سانتریفیوژ کوچک با سرعت بالا؛ اسپکتروفتومتر فرابنفش؛ میز لرزش دمای ثابت؛ تجهیزات کروماتوگرافی میل ترکیبی

 

1.2 روش ها

 

1.2.1 کشت تخمیر با چگالی بالا

سویه های کلیفرم نوترکیب واجد شرایط BL21-HP1036 و BL21-pa-lA بر روی محیط مصنوعی در 2% (V/V) تلقیح شدند و در دمای 37 درجه به مدت 35-40 ساعت کشت داده شدند.

 

1.2.2 بیان ناشی از پروتئین نوترکیب

هنگامی که محلول تخمیر OD{{0}}±0.1 بود، القاء شروع شد، دمای القاء 0.5±35 درجه بود و پس از 10 ساعت از القاء، کشت به پایان رسید.

 

1.2.3 خرد کردن و سانتریفیوژ همگن با فشار بالا

مایع باکتری که تست غیرفعال سازی را گذرانده بود به ترتیب با فشار 100 تا 150 مگاپاسکال توسط هموژنایزر فشار بالا برای ترک سلولی خرد شد. پس از خرد کردن، مایع خرد شده در دمای پایین نگه داشته شد.

مایع رویی با سانتریفیوژ با سرعت بالا، سرعت گریز از مرکز: 15{3}}00 دور در دقیقه، کنترل دما: 10 درجه ~ 15 درجه، سرعت تزریق: 0.5 ~ 1 لیتر در دقیقه به دست آمد، مایع رویی جمع آوری شد و مایع رویی با ظروفی که اندوتوکسین را حذف می کردند پر شد.

 

1.2.4 شفاف سازی کاست غشایی میکروفیلتراسیون

غشا با 10لیتر آب تصفیه شده در یک جهت شسته شد و فیلتراسیون جریان مماسی انجام شد. 300 میلی لیتر از سوسپانسیون باکتریایی شکسته پس از سانتریفیوژ از سانتریفیوژ خط لوله گرفته شد و با کاست غشایی میکروفیلتراسیون 0.45 میکرومتری شفاف شد. کدورت به ترتیب با نمونه برداری اندازه گیری شد و کدورت پس از سانتریفیوژ، کدورت مایع شفاف شده در کاست غشای میکروفیلتراسیون و کدورت مایع غلیظ در کاست غشای میکروفیلتراسیون مقایسه شد. محتوای پروتئین نمونه با کروماتوگرافی و الکتروفورز برای ارزیابی عملکرد پروتئین تشخیص داده شد.

 

مرحله 2: نتایج

2.1 داده های شفاف سازی و نتایج آزمایش پروتئین BL21-HP1036 و BL21-palA

نتایج در شکل. 1 نشان می دهد که کدورت مایع خرد کن اشریشیاکلی نوترکیب BL21-HP1036 و BL21-palA به ترتیب از 4 500 NTU و 4 000 NTU به 1970 NTU و 520 NTU کاهش یافته است. پس از سانتریفیوژ لوله کدورت اشریشیاکلی نوترکیب BL21-HP1036 و BL{10}}palA با روش کاست غشایی میکروفیلتراسیون به 25 NTU و 1.28 NTU کاهش یافت. مشاهده می شود که استفاده از فیلتراسیون جریان مماسی با کاست غشایی میکروفیلتراسیون و کانال جریان باز بهینه شده نسبت به فیلتراسیون سنتی سانتریفیوژ اثر خوبی بر کاهش اندوتوکسین، ویسکوزیته و کدورت مایع کروماتوگرافی دارد و می تواند به طور قابل توجهی هتروپروتئین نوترکیب E.coli را کاهش دهد. و اسید نوکلئیک

 

2.2 بازیابی پروتئین نمونه های BL21-HP1036 و BL21-palA

جدول 1 نشان می دهد که پروتئین نوترکیب اشرشیاکلی BL21-HP1036 هم در محلول شفاف شده با میکروفیلتراسیون و هم در مایع رویی غلیظ که توسط غشای میکروفیلتراسیون پوشانده شده است، و هم بازده کل پروتئین پس از بازیابی پروتئین از محلول شفاف شده با میکروفیلتراسیون و مایع رویی غلیظ وجود دارد. حدود 88.5 درصد است. پروتئین BL21-palA همچنین در محلول شفاف شده با اگزودای میکروفیلتراسیون و مایع رویی محلول غلیظ پوشیده شده توسط کاست غشایی میکروفیلتراسیون وجود داشت. بازده کل پروتئین BL21-PALA 81.5 درصد بود.

 

3. نتیجه گیری

در این مقاله، سویه‌های بیان‌کننده ژن‌های کلیدی BL{{0}}HP1036 و BL{21-palA استرپتوکوکوس suis و هموفیلوس پاراسوئیس به ترتیب تحت تخمیر چگالی بالا قرار گرفتند و کدورت مایع ماده را 45/0 عبور دادند. به طور قابل توجهی توسط فرآیند کاست غشایی میکروفیلتراسیون um کاهش می یابد، که نشان می دهد که فناوری فیلتراسیون جریان مماسی با کاست غشایی میکروفیلتراسیون بهتر از سانتریفیوژ با سرعت بالا بوده و می تواند به طور قابل توجهی پروتئین ناخالصی و اسید نوکلئیک اشریشیا کلی نوترکیب شکسته را کاهش دهد.

 

پس از جمع‌آوری مایع شفاف در کاست غشایی تک میکروفیلتراسیون، 62.9% وجود داشت، زیرا 37.1% از پروتئین هدف BL21-HP1036 کنسانتره میکروفیلتراسیون بود یا در کاست غشای میکروفیلتراسیون وجود داشت و سایر تلفات وجود داشت. یک روش دو مرحله ای برای شفاف سازی اتخاذ شد. در مرحله اول، از کاست غشایی میکروفیلتراسیون 0.45 میلیمتری برای شفاف سازی و جمع آوری اگزودا استفاده شد. در مرحله دوم، مایع غلیظ باقیمانده پس از سانتریفوژ لوله جمع آوری شد و مایع شفاف شده دو مرحله ای به عنوان نمونه کروماتوگرافی ترکیب شد. بیش از 85.5٪ و بازده پروتئین مایع تخمیر BL{12}}Pala می تواند پس از درمان دو مرحله ای به 81.5٪ برسد.

 

در مورد نحوه انتخاب کاست غشای میکروفیلتراسیون، فناوری Guidling می تواند راه حل های با کیفیتی را در اختیار شما قرار دهد. محصولات سری کاست غشای میکروفیلتراسیون و نوار کاست غشایی اولترافیلتراسیون ما از پلی اتر سولفون به عنوان حامل استفاده می کنند که مخصوص بیوتکنولوژی طراحی شده است. غشای سولفون پلی اتر ما دارای مزایای توان بالا، جذب پروتئین کم، استحکام مکانیکی بالا، مقاومت در برابر ضربه و غیره است. ما گیره های غشایی ویژه ای را برای اندازه گیری فشار ورودی و خروجی در زمان واقعی در اختیار شما قرار می دهیم و می توانیم بازدیدهای فنی را با توجه به نیاز شما برای سفارشی کردن سیستم اولترافیلتراسیون/میکروفیلتراسیون ویژه خود ارائه دهیم. چنین سیستم جریان مماسی کوچکی را می توان برای تولید کوچک، آزمایشی و در مقیاس کوچک مورد استفاده قرار داد و می تواند تقویت کننده کاملاً خطی باشد تا به طور کامل نیازهای تست و الزامات تولید شما را برآورده کند.

درباره هدایت

Guidling Technology یک شرکت ملی با فناوری پیشرفته است که بر روی بیوداروها، کشت سلولی، تصفیه و غلظت زیست پزشکی، تشخیص و مایعات صنعتی تمرکز دارد. ما دستگاه‌های فیلتر گریز از مرکز، کاست‌های اولترافیلتراسیون و میکروفیلتراسیون، فیلتر ویروس، سیستم TFF، فیلتر عمق، فیبر توخالی و غیره را با موفقیت توسعه داده‌ایم. غشاها و فیلترهای غشایی ما به طور گسترده در غلظت، استخراج و جداسازی پیش فیلتراسیون، میکروفیلتراسیون، اولترافیلتراسیون و نانوفیلتراسیون استفاده می شوند. خطوط تولید متعدد ما، از فیلتراسیون آزمایشگاهی کوچک و یکبار مصرف گرفته تا سیستم های فیلتراسیون تولید، آزمایش عقیم سازی، تخمیر، کشت سلولی و موارد دیگر، نیازهای آزمایش و تولید را برآورده می کند. Guidling Technology مشتاقانه منتظر همکاری با شما است!