تأثیر غلظت خوراک بر کاست‌های اولترافیلتراسیون چیست؟

هنگامی که من برای اولین بار کار با کاست های اولترافیلتراسیون (UF) را در روزهای اولیه خود به عنوان یک تامین کننده فیلتر شروع کردم، اعتراف می کنم که به غلظت خوراک بیشتر از بررسی اینکه آیا محلولی که در حال پردازش بودم «به اندازه کافی ضخیم است» فکر نکردم. این به سرعت تغییر کرد - زمانی که مشتری بیوتکنولوژی با مرحله غلظت آنتی بادی خود به دیوار برخورد کرد و گرفتگی مکرر و نرخ‌های شار متناقض عجیب و غریب را مقصر دانست. به نظر می رسد، آنها بسیار بیشتر از توانایی کاست UF خود فشار می آوردند و این برای آنها چند روز از کار افتادگی و یک سری محصول گران قیمت تمام شد. اگر با کاست‌های UF کار می‌کنید، این فقط یک جزئیات کوچک نیست، بلکه یکی از بزرگ‌ترین اهرم‌هایی است که فرآیند شما را، از بازده تا زمان اجرا، می‌سازد یا شکست می‌دهد. بیایید نحوه تأثیر غلظت خوراک بر هر بخش از UF و آنچه را که در طول سال‌ها آموخته‌ام تا کارها را روان نگه دارم، بررسی کنیم.

ابتدا، بیایید این را در آنچه که کاست‌های UF واقعا انجام می‌دهند، مشخص کنیم، فقط برای اینکه مطمئن شویم در همان صفحه هستیم. اگر در این بازی تازه کار هستید، یک کاست UF یک واحد مستقل با غشاهای تخت است (به ما مراجعه کنیدنوار کاست تختصفحه ای برای تجزیه کامل) که مولکول ها را بر اساس اندازه جدا می کند - مواد کوچک از غشاء عبور می کنند، در حالی که موارد بزرگتر "حفظ" می شوند و در سمت تغذیه متمرکز می شوند. چه چیزی آنها را در بیوفارما، غذا و نوشیدنی و فاضلاب بسیار محبوب کرده است؟ آنها جمع و جور، قابل استفاده مجدد هستند (گاهی اوقات، اگر به درستی تمیز شوند)، و نسبت به تنظیمات غشایی قدیمی تر، سازگارتر هستند. رااولترافیلتراسیون کاستخطی که ما ارائه می کنیم برای اجراهای مقیاس پذیر ساخته شده است، از دسته های آزمایشگاهی کوچک تا تولید کامل، به همین دلیل است که ما با مشتریانی از بیوتکنولوژی های نوپا گرفته تا مارک های جهانی مواد غذایی کار کرده ایم.

غلظت خوراک، برای کسانی که اصطلاحات را عمیقاً بررسی نکرده اند، اساساً مقدار املاح هدف (یا ناخواسته) در محلولی است که شما به داخل کاست پمپ می کنید. برای مثال، اگر آنتی‌بادی‌های مونوکلونال (mAbs) را از یک براث کشت سلولی متمرکز می‌کنید، غلظت خوراک در اینجا چند گرم mAb در هر لیتر از آن آبگوشت است. این فقط هدف نیست، شما ناخالصی هایی مانند بقایای سلولی، اجزای رسانه و نمک های بافر باقی مانده را نیز دارید. نقطه شیرین برای غلظت خوراک بسته به بریدگی وزن مولکولی غشا (MWCO) متفاوت است، درست است؟ یک کاست UF 30KD برای پروتئین های کوچک عالی عمل می کند، در حالی که یک کاست 500KD برای مولکول های بزرگتر مانند ناقل های ویروسی مناسب است. من مشتریانی را دیده ام که بدون توجه به غلظت خوراک، اولین کاست را که به آن نگاه می کنند، می گیرند و اشتباهات از اینجا شروع می شود.

بیایید با فوری ترین تأثیر شروع کنیم: نرخ شار. شار حجم محلولی است که در واحد سطح در ساعت از غشاء عبور می کند - این ستون فقرات بهره وری UF است. هنگامی که غلظت خوراک شما خیلی زیاد است، شار به سرعت کاهش می یابد، و نه به صورت خطی. دلیل این امر این است: همانطور که محلول را پردازش می کنید، املاح باقی مانده در نزدیکی سطح غشاء جمع می شوند و چیزی را تشکیل می دهند که "لایه قطبش غلظت" نامیده می شود. این لایه مانند یک مانع اضافی عمل می کند، بنابراین آب و املاح کوچک برای عبور از آن باید سخت تر کار کنند. اگر غلظت خوراک برای شروع بسیار بالا باشد، آن لایه پلاریزه به سرعت ضخیم می شود و به زودی شما به سختی هیچ گونه نفوذی را وارد می کنید. سال گذشته یک مشتری داشتم که یک کاست اولترافیلتراسیون 30 کیلو دالتون را روی مایع رویی کشت سلولی متراکم اجرا می کرد - آنها با 25 گرم در لیتر پروتئین تغذیه می کردند، زمانی که توصیه ما 10 تا 15 گرم در لیتر بود. شار آنها از 60 لیتر در متر مربع در ساعت به 12 لیتر در متر مربع در ساعت در 2 ساعت کاهش یافت و آنها مجبور شدند برای تمیز کردن زودرس کاست خاموش شوند و 12 ساعت زمان کار را تلف کنند. حتی بدتر از آن، قطبش غلظت بالا منجر به گیر کردن برخی از پروتئین ها در آن لایه شد، بنابراین بازده آنها 18٪ کمتر از حد انتظار بود.

اما این فقط شار نیست - غلظت خوراک مستقیماً به رسوب غشایی نیز مرتبط است که عامل بزرگ UF است. رسوب گیری زمانی اتفاق می افتد که املاح، زباله ها یا سنگدانه ها به طور دائم به سطح غشاء یا دیواره های منافذ بچسبند و با خوراک های بیش از حد غلیظ بدتر می شود. هنگامی که املاح در خوراک جمع می شوند، احتمال برخورد آنها با غشا و به دام افتادن بیشتر است. من صدها کاست UF را در طول سال‌ها تمیز کرده‌ام، و ۸۰٪ مواقع، رسوب‌های سنگین به غلظت خوراک بازمی‌گردد که ۲ تا ۳ برابر محدوده توصیه‌شده بود. به عنوان مثال، مشتری غذا که آب میوه را پردازش می‌کند، می‌خواهد به جای 15 درجه بریکس (که نقطه شیرین کاست 10 کیلو دتونی آن‌ها است) در یک مرحله بریکس 30 درجه تغلیظ کند. پکتین و شکر آبمیوه در عرض 30 دقیقه شروع به جمع شدن روی غشاء کردند و در پایان اجرا، منافذ غشا تا حدی مسدود شد، بنابراین آنها فقط یک چهارم غلظت مورد انتظار را به دست آوردند و مجبور شدند پس از سه بار به جای 10 بار، کاست را جایگزین کنند. این باعث شد هزینه‌های هر لیتر بسیار بالاتر از هزینه‌های هر لیتر نسبت به زمانی که آنها با غلظت کمتر به دو بار تقسیم می‌شدند.

عملکرد منطقه دیگری است که در آن غلظت خوراک به شدت تاثیر می گذارد، به خصوص در بیو داروها که هر گرم محصول اهمیت دارد. هنگامی که خوراک شما بیش از حد متمرکز باشد، نه تنها رسوب بیشتری دریافت می کنید، بلکه از دو طریق شاهد از دست دادن محصول نیز خواهید بود. اول، لایه پلاریزاسیون غلظت می تواند مولکول های هدف را بگیرد، و اگر خیلی ضخیم شود، ممکن است این مولکول ها به جای غلیظ شدن، هنگام تخلیه کاست، با محفظه جابجا شوند. دوم، برخی از مولکول‌های هدف (مانند پروتئین‌ها) می‌توانند در غلظت‌های بالا شروع به تجمع کنند، و آن دانه‌ها اغلب به اندازه‌ای کوچک هستند که از طریق غشاء بلغزند یا در تراوش گیر کنند، بنابراین آنها را از دست می‌دهید. یک مشتری ناقل ویروسی که سال گذشته با او کار کردم، از کاست اولترافیلتراسیون 500KD ما برای متمرکز کردن وکتورهای AAV استفاده می‌کرد - آنها غلظت خوراک را به 1e13 ژنوم ناقل در هر میلی‌لیتر رساندند، که بسیار بیشتر از توصیه ما برای 2e12 است. بازده آنها فقط 45 درصد بود در مقابل 82 درصدی که وقتی غلظت خوراک را به محدوده مناسب کاهش دادند. هنگامی که ما احتباس را آزمایش کردیم، متوجه شدیم که 30٪ از بردار هدف آنها در لایه قطبش غلظت گیر کرده است و 15٪ دیگر جمع شده و از بین رفته است. این همان ضربه‌ای است که می‌تواند کل دسته را بی‌ارزش کند، به‌ویژه زمانی که با فرآیندهای سازگار با GMP سر و کار دارید که در آن نمی‌توانید محصول بیشتری را به دلخواه بسازید.

صبر کنید، اما قبل از اینکه فکر کنید "غلظت کمتر خوراک همیشه بهتر است" - این نیز درست نیست. اگر فید شما خیلی رقیق است، زمان و ظرفیت کاست را تلف می‌کنید. زمانی که محلول را تا حد معقولی متمرکز می‌کنید، UF کارآمدتر است، اما اگر با خوراکی بسیار نازک شروع کنید، حجم بیشتری نسبت به آنچه نیاز دارید حرکت می‌دهید، که هزینه‌های انرژی برای پمپاژ را افزایش می‌دهد و رسیدن به غلظت هدف زمان بیشتری می‌برد. به عنوان مثال، یک مشتری آزمایشگاهی که یک نمونه پروتئین کوچک را تغلیظ می کرد از یک کاست 10 کیلو دالتون با غلظت خوراک 0.1 میلی گرم در میلی لیتر استفاده می کرد - آنها سعی داشتند به 10 میلی گرم در میلی لیتر برسند، بنابراین در حال پردازش 100 میلی لیتر محلول برای دریافت 10 میلی لیتر ماده نگهدارنده بودند. 8 ساعت طول کشید، در مقابل 2 ساعت زمانی که ابتدا خوراک را از طریق سانتریفیوژ تا 0.5 میلی گرم بر میلی لیتر تغلیظ کردند، بنابراین فقط 20 میلی لیتر را پردازش کردند. این تفاوت بسیار زیادی در کار و زمان است، به خصوص اگر چندین بار در روز اجرا می کنید. کلید رسیدن به محدوده میانی است - چیزی که من آن را "پنجره تمرکز" برای کاست و برنامه خاص شما می نامم.

پس چگونه آن پنجره تمرکز را دریابید؟ این یک اندازه نیست، اما چند قانون کلی وجود دارد که ما با همه مشتریان خود به اشتراک می گذاریم. ابتدا، MWCO کاست خود را بررسی کنید: یک کاست با MWCO بالاتر (مانند 500KD) معمولا می تواند غلظت خوراک بالاتری نسبت به MWCO کمتر (مثل 30KD) داشته باشد، زیرا منافذ بزرگتر هستند، بنابراین پلاریزاسیون مشکل کمتری دارد. ماسری کاست-TFF-فیلتراسیونصفحه دارای محدوده غلظت خاصی برای هر کاست است، اما به عنوان یک قاعده کلی، هرگز از 10 تا 15 درصد مواد جامد برای بیشتر کاربردهای پروتئین و 5 تا 10 درصد برای مولکول‌های کوچک بالاتر نروید. دوم، خوراک خود را از نظر ناخالصی آزمایش کنید: اگر خوراک شما دارای مواد زائد یا سنگدانه های زیادی است، بدون توجه به اینکه مولکول مورد نظر شما چیست، به غلظت خوراک کمتری برای جلوگیری از رسوب نیاز دارید. سوم، ابتدا آزمایش‌های مقیاس کوچک را اجرا کنید - فقط به تولید کامل نروید. یک آزمایش 100 میلی لیتری یا 1 لیتری دقیقاً به شما می گوید که چه شار دریافت می کنید، چقدر سریع رسوب ایجاد می کند و چه بازدهی را می توانید انتظار داشته باشید، بنابراین محصول ارزشمند را هدر ندهید.

نکته دیگری که در طول سال ها متوجه شده ام این است که غلظت خوراک با سایر پارامترهای فرآیند، مانند سرعت جریان متقاطع و فشار غشایی (TMP) در تعامل است. این مانند تنظیم غلظت در خلاء نیست - اگر غلظت تغذیه بالایی دارید، می توانید با افزایش سرعت جریان متقاطع، که لایه پلاریزاسیون را از سطح غشاء دور می کند، و افزایش TMP (اما نه بیش از حد، زیرا TMP می تواند باعث تراکم لایه قطبی شود) کمی جبران کنید. اما این یک عمل متعادل کننده است: جریان متقاطع بالاتر به معنای انرژی بیشتر است و اگر مراقب نباشید TMP بالاتر می تواند منجر به آسیب غشاء شود. ما همیشه به مشتریان توصیه می‌کنیم که تست‌های پارامتر کاملی را که شامل غلظت خوراک است انجام دهند، زیرا تغییر یکی می‌تواند بقیه را از بین ببرد. به عنوان مثال، یک مشتری یک بار سعی کرد افت شار ناشی از غلظت بالای خوراک را با بالا بردن TMP برطرف کند و در نهایت غشا را فشرده کرد، بنابراین اجرای بعدی آنها شار کمتری داشت. به همین دلیل است که در شرکت ما، ما فقط کاست نمی‌فروشیم، بلکه به مشتریان خود کمک می‌کنیم تا از طریق این پیچیدگی‌های فرآیند کار کنند، زیرا تقریباً هر اشتباهی را که می‌توانید در مورد تمرکز خوراک مرتکب شوید، دیده‌ایم.

بیایید در مورد اثرات بلندمدت نیز صحبت کنیم، زیرا غلظت خوراک تنها بر یک بار اجرا تأثیر نمی گذارد، بلکه بر طول عمر کاست تأثیر می گذارد. اگر با فیدهای بیش از حد غلیظ کار می کنید، رسوب بیشتری ایجاد می کنید، به این معنی که باید نوار کاست را بیشتر تمیز کنید و مواد تمیزکننده تهاجمی تری (مانند PH یا درجه حرارت بالاتر) برای خلاص شدن از شر تجمع ها ایجاد می کنید. با گذشت زمان، این تمیز کردن تهاجمی غشاء را تخریب می کند، بنابراین نوار کاست قبل از اینکه نیاز به تعویض داشته باشد، جریان کمتری در آن دارد. من مشتری داشتم که کاست صفحه تخت ما را اجرا می کرد، و در مرحله پنجم، به دلیل رسوب زیاد، مجبور شدند آن را تعویض کنند، در حالی که مشتری دیگری که همان کاست را با غلظت خوراک مناسب اجرا می کرد، 15+ اجرا می کرد. این تفاوت هزینه زیادی است وقتی که هر هفته در مقایسه با هر ماه کاست ها را مرور می کنید.

اکنون، بیایید عملی شویم - اگر غلظت خوراک شما کم است، واقعاً چه کاری باید انجام دهید؟ ابتدا آن را به درستی اندازه گیری کنید. بسیاری از مشتریان از "ضخامت بصری" راه حل استفاده می کنند که بسیار نادرست است. از دستگاه بریکس متر برای محصولات غذایی یا جذب (مانند A280 برای پروتئین ها) برای به دست آوردن غلظت دقیق استفاده کنید. سپس، خوراک خود را با رقیق کردن آن (اگر خیلی زیاد است) یا با یک مرحله پیش پردازش کوچکتر (مثل فیلتراسیون جریان مماسی با یک کاست متفاوت یا سانتریفیوژ) متمرکز کنید، اگر خیلی کم است. اگر با یک خوراک بی‌نظیر مانند یک بیولوژیک سفارشی سروکار دارید، با تیم ما تماس بگیرید—ما متخصصان برنامه‌ای داریم که می‌توانند به شما در طراحی فرآیندی متناسب با غلظت خوراک شما کمک کنند، چه انتخاب MWCO مناسب (مانند 30 کیلو دات در مقابل 500 کیلو دات)، تنظیم جریان متقاطع، یا تعیین بهترین زمان اجرا.

من نمی توانم به اندازه کافی تاکید کنم که چقدر تغییرات کوچک برای تغذیه تمرکز می تواند کل فرآیند UF شما را تغییر دهد. این یک جزئیات خسته کننده نیست - این تفاوت بین دویدنی است که تمام اهداف بازدهی و جدول زمانی شما را برآورده می کند، و دویدنی که روزها باعث عیب یابی، هدر دادن محصول و پول شما می شود. ما خودمان را ساخته ایماولترافیلتراسیون کاستخط انعطاف پذیر باشد، با گزینه هایی برای MWCO های مختلف (مانند ماکاست اولترافیلتراسیون 30 کیلوییوکاست اولترافیلتراسیون 500KD)، طرح های صفحه تخت، و تنظیمات سری TFF، زیرا می دانیم که فید هر مشتری متفاوت است. اگر با مشکلات غلظت خوراک مشکل دارید، یا فقط می‌خواهید فرآیند UF خود را کارآمدتر کنید، ما اینجا هستیم تا به شما کمک کنیم—ما با هزاران مشتری کار کرده‌ایم تا پنجره‌های غلظت آنها را درست کنیم، و می‌توانیم همین کار را برای شما انجام دهیم. اجازه ندهید جزئیات کوچکی مانند غلظت خوراک باعث از بین رفتن دویدن شما شود - امروز با تیم ما تماس بگیرید تا درباره بهینه سازی فرآیند خود بیشتر بدانید.

مراجع

1. بلفورت، جی، دیویس، RH، و زیدنی، AL (1994). رفتار سوسپانسیون ها و محلول های ماکرومولکولی در میکروفیلتراسیون جریان متقاطع مجله علم غشاء، 96 (1-2)، 1-58.
2. Charcosset, C. (2007). پلاریزاسیون هیدرودینامیکی و غلظت در اولترافیلتراسیون: بررسی نمک زدایی، 211 (1-3)، 108-122.
3. Zydney، AL (2018). فیلتراسیون جریان مماسی برای پردازش بیودارویی نظر فعلی در مهندسی شیمی، 20، 109-115.
4. مولدر، ام (1996). اصول اولیه فناوری غشاء (ویرایش دوم). ناشران آکادمیک Kluwer.