کاربرد اولترافیلتراسیون در تولید واکسن هاری انسانی

به منظور ترویج کاربرد اولترافیلتراسیون در تولید واکسن هاری انسانی، کاست غشایی اولترافیلتراسیون 300 کیلو دالتون برای تغلیظ محلول برداشت ویروس هاری و تشخیص بازیابی آنتی ژن، سرعت حذف اندوتوکسین و سرعت حذف پروتئین میزبان پس از اولترافیلتراسیون استفاده شد. نتایج نشان داد که تحت فشار مناسب، محلول برداشت ویروس هاری 80 بار تغلیظ شد، 25 بار شستشو داده شد، میزان بازیابی آنتی ژن 86.2%، میزان حذف اندوتوکسین باکتریایی 87.5% ~ 88.7% بود. میزان حذف پروتئین میزبان 91.6٪ بود.

 

پیشگفتار

 

هاری یک بیماری مشترک سنتی و قدیمی است که توسط ویروس هاری (RV) ایجاد می شود و میزان مرگ و میر آن تا 100٪ می رسد. در حال حاضر، هیچ درمان موثری برای پس از مواجهه (یعنی آسیب به پوست و غشاهای مخاطی) به جز واکسن اورژانسی و واکسیناسیون ایمونوگلوبولین وجود ندارد. منبع اصلی هاری در انسان نیش حیوانات بیمار یا بالقوه آلوده (عمدتا سگ) است. نرخ مرگ و میر ناشی از هاری در چین در رتبه دوم جهان قرار دارد و هاری یکی از مشکلاتی است که امنیت بهداشت عمومی در کشور ما را تهدید می کند. گلیکوپروتئین کپسولی ویروس هاری که تنها آنتی ژن کلیدی است که تولید آنتی بادی خنثی کننده محافظ را القا می کند، کانون تحقیقات و توسعه واکسن های جدید و فناوری های جدید تشخیص و درمان ویروس هاری بوده است.

 

ویروس هاری متعلق به جنس ویروس هاری از خانواده رابدویروس ها است. شکل نوکلئوکپسید الاستیک، نوکلئوکپسید به صورت مارپیچ متقارن است و سطح دارای پوششی حاوی RNA تک رشته ای است. عامل بیماری هاری است. ویروس هاری دو آنتی ژن اصلی دارد: یکی آنتی ژن گلیکوپروتئین روی غشای خارجی ویروس است که می تواند به گیرنده استیل کولین متصل شود تا ویروس را عصبی کند و آنتی بادی های خنثی کننده و آنتی بادی های مهار کننده هماگلوتیناسیون را در بدن تولید کند و آنتی بادی های خنثی کننده یک اثر محافظتی؛ دیگری آنتی ژن ریبوپروتئین داخلی است که می تواند بدن را وادار به تولید آنتی بادی های اتصال مکمل و رسوب کند و هیچ اثر محافظتی ندارد.

 

اندوتوکسین نوعی ماده لیپوپلی ساکارید (LPS) است که مقاومت حرارتی و پایداری شیمیایی دارد و به راحتی از بین نمی رود. اگر غلظت مشخصی از اندوتوکسین در واکسن وجود داشته باشد، باعث تب شدید و حتی مرگ پس از واکسیناسیون می شود، بنابراین باید میزان اندوتوکسین در واکسن تا حد امکان کاهش یابد. نسخه 2005 فارماکوپه چینی (قسمت III) تعیین کرد که مقدار کنترل شاخص واجد شرایط اندوتوکسین واکسن هاری نباید بیشتر از 100EU/دوز باشد. با توسعه سریع فناوری جداسازی غشایی، استفاده از فناوری جداسازی غشایی اولترافیلتراسیون برای کاهش محتوای اندوتوکسین در واکسن ها در صنعت داروسازی روز به روز گسترده تر می شود.

 

واکسن هاری واکسن ضد هاری است. معمولاً سه نوع واکسن هاری وجود دارد که شامل واکسن سلولی ورو خالص شده، واکسن سلول دیپلوئید انسانی و واکسن کشت سلولی اولیه می‌شود. واکسن هاری با تلقیح ویروس تثبیت شده ویروس هاری به ماتریکس سلولی، پس از کشت، برداشت، غلظت، غیرفعال سازی، خالص سازی و افزودن تثبیت کننده مناسب ساخته می شود. عملکرد اصلی واکسن هاری تحریک بدن برای تولید پاسخ ایمنی سریع و تولید آنتی بادی های محافظ در برابر ویروس هاری است تا از عفونت ناشی از ویروس جلوگیری کرده و خطر ابتلا به بیماری را کاهش دهد.

 

 

فرآیند تولید واکسن نقش مهمی در تضمین کیفیت واکسن ایفا می کند، به ویژه کمی سازی برخی از شاخص ها در فرآیند تولید اهمیت بیشتری دارد. در فرآیند تولید واکسن هاری انسانی، فناوری غلظت اولترافیلتراسیون وسیله ضروری برای تولید واکسن هاری انسانی است. استفاده از غشای اولترافیلتراسیون دیافراگم معقول برای غلظت اولترافیلتراسیون می تواند به طور موثر اندوتوکسین و پروتئین میزبان را حذف کند و آنتی ژن RV را حفظ کند، که منجر به تولید واکسن و بهبود کیفیت می شود. جرم مولکولی نسبی مولکول های RV 350kDa ~ 460kDa است و در تئوری، RV می تواند به طور کامل با غلظت اولترافیلتراسیون با استفاده از کاست غشایی با وزن مولکولی رهگیری 100kDa و 300kDa به دام بیفتد. اندوتوکسین اغلب در محلول های آبی مختلف ساختار دانه ای را تشکیل می دهد، به دلیل درجه تجمع، اندازه مولکولی متفاوت است. جرم مولکولی نسبی مونومر اندوتوکسین 10kDa ~ 20kDa است و جرم مولکولی نسبی فرم پلیمریزاسیون آن 300kDa ~ 1000kDa یا بیشتر از 1000kDa است. بر اساس تفاوت در وزن مولکولی، آنتی ژن RV در واکسن هاری انسانی حفظ شد و اندوتوکسین و پروتئین میزبان در واکسن هاری انسانی توسط غشای اولترافیلتراسیون 300 کیلو دالتونی حذف شد.

 

در این آزمایش، کاست غشایی اولترافیلتراسیون با دیافراگم 300 کیلو دالتون و سطح غشاء 0.11 متر مربع به عنوان تیمار نمونه کوچک برای تغلیظ محصولات میانی واکسن هاری انسانی و شار غشایی، کارایی درمان، غلظت چندگانه، رهگیری آنتی ژن، حذف اندوتوکسین استفاده شد. و حذف پروتئین میزبان مورد آزمایش قرار گرفت.

 

2روش مواد

 

2.1 مواد آزمایشی

ویروس هاری ویروس ثابت سویه CTN-IV. سلول های Vero; 0.5M هیدروکسید سدیم; کاست غشایی اولترافیلتراسیون 0 کیلو دالتون (مواد PES، مساحت غشاء 0.11 متر مربع).

 

2.2 روش های تجربی

2.2.1 تهیه محلول جمع آوری ویروس

سلول‌های ورو منجمد در آب گرم در دمای 37 تا 39 درجه احیا شدند، سوسپانسیون سلولی جرعه جرعه جرعه جرعه خورده شد و سپس به محیط کشت 199 حاوی 10% سرم غیرفعال گوساله اضافه شد. سلولهای تک لایه یکنواخت در دمای 37 درجه کشت داده شدند. سویه CTN-IV با ویروس هاری به نسبت 0.1mol/L تلقیح شد و در دمای 37 درجه کشت شد. پس از 48 ساعت، محیط کشت دور انداخته شد و 199 محیط کشت حاوی 1/0 درصد آلبومین خون انسان برای حفظ کشت در دمای 33 تا 35 درجه اضافه شد. زهر بیماری را هر 3 روز{16} روز یک بار برداشت کنید و چند مایع برداشت را با هم ترکیب کنید.

 

2.2.2 نصب کاست غشایی

نوار کاست ممبران را نصب کرده و سیم کشی را مطابق شکل زیر وصل کنید.

 

2.2.3 شستشو با آب

شیر ورودی، شیر برگشتی و شیر عبوری را ببندید و انتهای برگشت و لوله انتهایی را در مخزن مایع زباله قرار دهید. مخزن ورودی را با 1 لیتر آب برای تزریق پر کنید.

شیرهای ورودی و برگشت را باز کنید، شیرهای عبوری را ببندید، پمپ را باز کنید، خط برگشت را با 10 درصد حجم آب تصفیه شده یا آب تزریقی تمیز کنید و فشار ورودی را روی 0.35bar (5psi) نگه دارید.

شیر فیلتر را باز کنید، شیر برگشت را ببندید و از آب تزریق باقیمانده برای تمیز کردن لوله فیلتر استفاده کنید و TMP را روی 0.35bar نگه دارید.

 

2.2.4 ضد عفونی

شیر ورودی، شیر برگشت و شیر انتقال را ببندید و انتهای برگشت و خطوط انتهای انتقال را در مخزن مایع زباله قرار دهید. مخزن ورودی را با 2 لیتر محلول تمیز کننده پر کنید.

دریچه های ورودی و برگشتی را باز کنید، شیرهای عبوری را ببندید، پمپ را باز کنید، خط برگشت را با 200 میلی لیتر هیدروکسید سدیم 0.5M تمیز کنید و فشار ورودی را روی 0.35bar (5psi) نگه دارید. .

شیر عبوری را باز کنید، دریچه برگشت را ببندید و لوله عبوری را با حجم 200 میلی لیتر محلول تمیزکننده تمیز کنید و TMP را در 0.35 بار نگه دارید.

سپس انتهای برگشت و لوله انتهایی برای تمیز کردن چرخه ای وارد مخزن مایع می شوند. تمیز کردن چرخه ای با 1 تا 1.5 برابر جریان مماس فرآیند به مدت 30 دقیقه.

0.5M هیدروکسید سدیم را تخلیه کنید و با آب تزریقی مطابق 2.2.4 بشویید تا خنثی شود.

 

2.2.5 تست شار آب

آب تصفیه شده را به مخزن ورودی اضافه کنید، دمای آب را در مخزن ورودی اندازه گیری و ثبت کنید. انتهای برگشت را داخل مخزن قرار دهید. پمپ را راه اندازی کنید و سرعت پمپ و شیر برگشتی را تنظیم کنید تا به اختلاف فشار گذر غشایی 0.35bar (5psi) برسید. با استفاده از یک سیلندر، سرعت جریان را در انتها بر حسب میلی لیتر در دقیقه اندازه گیری و ثبت کنید. سرعت پمپ و شیر برگشت را تنظیم کنید تا فشار دیفرانسیل غشایی 1bar (15psi) بدست آید. با استفاده از یک سیلندر، سرعت جریان را در انتها بر حسب میلی لیتر در دقیقه اندازه گیری و ثبت کنید.

برای استاندارد کردن مقدار جریان آب، مقدار دبی آب محاسبه شده را بر اختلاف فشار غشایی تقسیم کرده و ضریب تصحیح دما را در جدول زیر ضرب کنید.

 

2.2.6 غلظت اولترافیلتراسیون

آب را از سیستم با بافر بالا بشویید. برای تنظیم pH و ثبات یونی سیستم به مدت 5 دقیقه چرخه بزنید. اگر دما نیاز به تنظیم دارد، چرخه را تا زمانی که دمای سیستم ثابت شود ادامه دهید.

مایع تغذیه را به مخزن ورودی اضافه کنید، یک نرخ جریان تغذیه (به عنوان مثال 400LMH) تنظیم کنید و سرعت جریان عبوری را در مقادیر مختلف TMP آزمایش کنید. با توجه به داده های آزمون، منحنی ها با TMP به عنوان آبسیسا و Flux به عنوان مختصات رسم شدند.

لوله سرتاسری را به یک ظرف یا زهکش مناسب، مانند مخازن جمع آوری سرتاسری، مخازن مایع زباله و زهکشی فرآیند هدایت کنید.

وزن اولیه مایع خوراک را در مخزن تغذیه ثبت کنید، پمپ تغذیه را راه اندازی کنید و به آرامی مایع خوراک را به مدت 3 تا 4 دقیقه در گردش قرار دهید. گردش مجدد می تواند به حذف هوای باقی مانده در مسیر جریان کمک کند و در نتیجه عملکرد فیلم را به حداکثر برساند.

شیر عبوری را باز کنید، به آرامی سرعت پمپ را تا رسیدن به دبی مماسی بهینه افزایش دهید و شیر برگشت را برای رسیدن به TMP بهینه سیستم تنظیم کنید.

سپس لوله را در ظرف جمع آوری قرار دهید، زمانی که مایع وارد ظرف شد شروع به زمان بندی کنید و فشار ورودی و برگشتی را در فواصل مناسب ثبت کنید و کیفیت مایع را در طول زمان در انتهای برگشت و انتهای عبور ثبت کنید تا لحظه ای محاسبه شود. نرخ جریان.

غلظت اولترافیلتراسیون نمونه زمانی تکمیل می شود که حجم مایع خوراک به حجم غلظت هدف کاهش یابد.

 

2.2.7 دیالیز

لوله ورودی، لوله پر کردن و لوله برگشت را در مخزن ورودی قرار دهید، لوله انتقال را در ظرف جمع آوری قرار دهید و ظرف جمع آوری را روی تعادل قرار دهید تا پاک شود.

شیر برگشت را باز کنید، پمپ ورودی را راه اندازی کنید، شیر عبوری را باز کنید، سرعت پمپ و TMP را به مقدار مناسب تنظیم کنید. پمپ پر کردن را باز کنید، حجم مایع را در مخزن ورودی بدون تغییر نگه دارید و دیالیز با حجم برابر را شروع کنید. زمانی که مایع وارد ظرف می شود زمان بندی را شروع کنید و فشار در انتهای ورودی، انتهای برگشت و جرم مایع را در بازه زمانی مناسب ثبت کنید و با محاسبه دبی آنی را بدست آورید.

 

2.2.8 CIP

ابتدا با بافر شستشو دهید، سپس با آب برای تزریق بشویید (عملیات 2.2.3)، سپس با ماده تمیز کننده (عملیات 2.2.4) تمیز کنید، و در نهایت با آب برای تزریق بشویید (عملیات 2.2.3).

 

2.2.9 آزمایش شار آب

عملیات به شرح زیر است: 2.4.5.

 

2.2.10 حفظ کاست غشایی

ذخیره سازی کوتاه مدت (کمتر یا مساوی 3 روز)، کاست غشایی را در فیکسچر نگه دارید و از محلول ذخیره سازی برای چرخه به مدت 10 دقیقه تا 15 دقیقه استفاده کنید، شیر سیستم را ببندید، منبع تغذیه پمپ مایع را قطع کنید و اطمینان حاصل کنید. که مخزن ورودی مایع به درستی آب بندی شده باشد.

اگر زمان نگهداری 3 روز تا 1 ماه است، لطفاً نوار کاست غشایی را از فیکسچر خارج کرده و آن را در یک کیسه پلاستیکی یا سایر ظروف بدون هوا ببندید. حدود 50 تا 100 میلی لیتر از محلول ذخیره سازی را به یک کیسه پلاستیکی یا ظرف دربسته اضافه کنید و آن را ببندید. یا می توان آن را مستقیماً در محلول ذخیره سازی غوطه ور کرد. جدول زیر شرایط نگهداری را توصیه می کند.

 

3 نتایج و تجزیه و تحلیل

 

3.1 بررسی عوامل موثر بر راندمان حذف پیروژن

فشار عملیات اولترافیلتراسیون: 15 دسته آزمایشی به طور مداوم اجرا شد. در هر دسته، فشار فیلتراسیون در حین اولترافیلتراسیون 5، 10، 15 و 2{{1{12}}}}psi حفظ شد و مایع جمع‌آوری ویروس 30 بار غلیظ شد و با مایع بافر شسته شد. (10 برابر حجم) در جریان پیوسته. نتایج همانطور که در جدول زیر نشان داده شده است، میزان حذف اندوتوکسین کمتر از 87.0٪ بود، نرخ بازیابی آنتی ژن در 86.0٪ ثابت بود، و میزان حذف پروتئین میزبان در 90.0٪ ثابت بود که نشان می دهد. فشارهای عملیاتی مختلف تأثیر کمی بر اثر بازیابی آنتی ژن، حذف اندوتوکسین و حذف پروتئین میزبان داشتند.

نسبت غلظت اولترافیلتراسیون: 15 دسته آزمایشی به طور مداوم اجرا شد. در هر دسته، مایع برداشت ویروس به ترتیب 3{12}} بار، 50 بار، 80 بار و 100 بار در طول اولترافیلتراسیون غلیظ شد. فشار فیلتراسیون در 20psi حفظ شد و مایع بافر (10 برابر حجم) در جریان پیوسته شسته شد. نتایج همانطور که در جدول زیر نشان داده شده است، میزان حذف اندوتوکسین از 53.3٪ تا 86.9٪، نرخ بازیابی آنتی ژن در 86.0٪ ثابت باقی ماند و میزان حذف پروتئین میزبان ثابت ماند. در 91.0 درصد ثابت بود. در نمونه برداری قطعه بندی شده، هیچ آنتی ژنی در محلول انتقال شناسایی نشد و کمتر از 10 درصد پروتئین میزبان در محلول غلیظ ویروس باقی ماند. غلظت اندوتوکسین در محلول غلیظ ویروس با افزایش دفعات غلظت افزایش یافت و میزان حذف اندوتوکسین در نمونه غلیظ 80 برابر بالاترین بود و سازنده می توانست غلظت آن را 100 برابر نیز در نظر بگیرد که نه تنها راندمان تولید را بهبود بخشید و هزینه را کاهش داد، اما الزامات تولید واکسن را نیز برآورده کرد.

 

3.2 کاهش شار کاست غشایی و بازسازی پاکسازی

پس از درمان، نرخ بازیابی شار غشایی 92.6٪ بود. اولین نرخ بازیابی کاست غشایی جدید نرمال است، با توجه به ویژگی های مشاهده فعلی مایع خوراک، پیش بینی بعدی بار دوم و NTH، نرخ بازیابی شار کاست غشایی پس از این درمان به داده ها نزدیک خواهد شد، و تمایل به پایدار بودن دارند ظرف 2 ساعت از یک بار استفاده، تخلیه کاست غشایی ایده آل بود و تنها 10٪ از شار غشاء تحت عملیات کلی تخلیه شد.

3.2.1 کاهش شار در فرآیند درمان کاست غشایی

3.2.2 نتیجه تمیز کردن و بازسازی کاست غشایی

 

درباره هدایت

 

Guidling Technology یک شرکت ملی با فناوری پیشرفته است که بر روی بیوداروها، کشت سلولی، تصفیه و غلظت زیست پزشکی، تشخیص و مایعات صنعتی تمرکز دارد. ما دستگاه‌های فیلتر گریز از مرکز، کاست‌های اولترافیلتراسیون و میکروفیلتراسیون، فیلتر ویروس، سیستم TFF، فیلتر عمق، فیبر توخالی و غیره را با موفقیت توسعه داده‌ایم. غشاها و فیلترهای غشایی ما به طور گسترده در غلظت، استخراج و جداسازی پیش فیلتراسیون، میکروفیلتراسیون، اولترافیلتراسیون و نانوفیلتراسیون استفاده می شوند. خطوط تولید متعدد ما، از فیلتراسیون آزمایشگاهی کوچک و یکبار مصرف گرفته تا سیستم های فیلتراسیون تولید، آزمایش عقیم سازی، تخمیر، کشت سلولی و موارد دیگر، نیازهای آزمایش و تولید را برآورده می کند. Guidling Technology مشتاقانه منتظر همکاری با شماست!