کاربردUفیلتراسیون درEاستخراج ازNطبیعیCالاژن

 

Ⅰ. کلاژن چیست

کلاژن یک بیوپلیمر، جزء اصلی در بافت همبند حیوانات، و همچنین فراوان ترین و پراکنده ترین پروتئین عملکردی در پستانداران است که 25 تا 30 درصد کل پروتئین و حتی تا بیش از 80 درصد در برخی از آنها را تشکیل می دهد. ارگانیسم ها نقش بافت پیوندی در سلول های حیوانی را ایفا می کند.

بر اساس اندازه گیری ها، یک فرد بالغ حدود 3 کیلوگرم کلاژن در بدن خود دارد که عمدتاً در پوست، استخوان ها، چشم ها، دندان ها، تاندون ها، اندام های داخلی (از جمله قلب، معده، روده و رگ های خونی) و سایر قسمت ها وجود دارد. از بدن انسان عملکرد آن حفظ مورفولوژی و ساختار پوست و اندام ها است و همچنین یک ماده خام مهم برای ترمیم بافت های آسیب دیده است.

II. استخراج کلاژن از مقیاس ماهی کپور با اولترافیلتراسیون

1. مواد و روش ها

1.1 نمونه های آزمایشی

عصاره آبی کلاژن خام.

1.2 روش های تست

1.2.1 فرآیند اولترافیلتراسیون

1.2.2 تعیین فرآیند پیش فیلتراسیون

در این آزمایش، فرآیند بهینه پیش فیلتراسیون از طریق تحلیل مقایسه ای روش فیلتراسیون خلاء و روش میکروفیلتراسیون تعیین می شود. روش های ویژه آزمون به شرح زیر است:

① عصاره آبی کلاژن خام با روش فیلتراسیون خلاء کاغذ صافی فیلتر می شود تا ذرات معلق و ناخالصی های موجود در عصاره آبی حذف شود.

② عصاره آبی کلاژن خام با یک غشای میکروفیلتراسیون 0.2 میکرومتر برای حذف مواد نامحلول، ناخالصی‌ها و غیره در عصاره آبی فیلتر می‌شود.

1.2.3 انتخاب اندازه منافذ غشاء اولترافیلتراسیون

در طول تصفیه، اندازه منافذ غشای اولترافیلتراسیون 100 کیلو دالتون است.

1.2.4 آزمایش تک عاملی فرآیند تصفیه اولترافیلتراسیون

عصاره آبی کلاژن خام با تکنولوژی اولترافیلتراسیون خالص سازی می شود. آزمایش تک عاملی تأثیر فشار عملیاتی، دمای عملیاتی و pH بر حفظ کلاژن را مطالعه کنید. پس از راه اندازی تجهیزات اولترافیلتراسیون برای مدتی، تأثیر عوامل مختلف بر میزان احتباس کلاژن را مطالعه کنید.

1.2.5 فرمول محاسبه

2. نتایج و تجزیه و تحلیل

2.1 تجزیه و تحلیل فرآیند قبل از فیلتراسیون

برای مقایسه نتایج روش فیلتراسیون خلاء و روش میکروفیلتراسیون به جدول زیر مراجعه کنید.

روش فیلتراسیون	غلظت محلول قبل از فیلتراسیون/(g/L)	غلظت محلول پس از فیلتراسیون/(g/L)	پدیده های حسی
روش فیلتراسیون خلاء	0.45	0.35	محلول در پایان فیلتراسیون شفاف است اما پس از مدتی ماندن کدر می شود.
روش میکروفیلتراسیون	0.45	0.42	محلول در پایان فیلتراسیون شفاف است و پس از مدتی ماندن شفاف می ماند

 

از جدول می توان دریافت که هم روش فیلتراسیون خلاء و هم روش میکروفیلتراسیون می توانند ناخالصی ها و جامدات نامحلول موجود در محلول را حذف کنند، اما روش میکروفیلتراسیون اثر حفاظتی بهتری روی پروتئین دارد، یعنی اتلاف آن قابل توجه نیست و روش فیلتراسیون خلاء ممکن است باعث از دست دادن پروتئین شود. علاوه بر این، فیلتر پس از قرار گرفتن برای مدتی توسط فیلتراسیون خلاء، کدر می شود، در حالی که میکروفیلتراسیون هنوز شفاف و شفاف است، بنابراین میکروفیلتراسیون به عنوان فرآیند پیش تصفیه اولترافیلتراسیون انتخاب می شود.

2.2 آزمون تک عاملی فرآیند اولترافیلتراسیون

2.2.1 اثر فشار اولترافیلتراسیون بر میزان ماندگاری

تحت شرایط دمای 40 درجه و pH 9.0، تأثیر فشارهای مختلف اولترافیلتراسیون (0.07MPa، 0 را مطالعه کنید.{ {11}}9MPa، 0.11MPa، 0.13MPa و 0.15MPa) بر میزان حفظ پروتئین. نتایج در شکل زیر نشان داده شده است.

 

همانطور که از شکل بالا مشخص است، با افزایش فشار عملیاتی، سرعت رهگیری پروتئین به تدریج کاهش یافت. در {{0}}.07MPa، نرخ حفظ پروتئین 96.53% است، زمانی که فشار عملیاتی 0.15MPa باشد، نرخ حفظ پروتئین 84.38% است. به این دلیل است که جداسازی مواد توسط اولترافیلتراسیون توسط اختلاف فشار انجام می شود. در آن محدوده فشار کاری کم، ماده مولکولی کوچک می تواند به سرعت از غشاء عبور کند، اما مواد ماکرومولکولی می توانند توسط غشای اولترافیلتراسیون به دام افتاده و در سطح غشاء جمع شوند و در حال حاضر، سطح غشاء و مایعات آبی عصاره تفاوت غلظت برای ایجاد اختلاف غلظت مقاومت قطبش. اما با افزایش فشار، مقاومت قطبش غلظت به تدریج افزایش می یابد و اختلاف غلظت بین سطح غشا و عصاره آبی به تعادل می رسد. هنگامی که فشار از این تعادل فراتر رفت، می توان یک لایه ژل روی سطح غشاء نوشت (که با تئوری قطبش غلظت و لایه ژل تشکیل شده در طول اولترافیلتراسیون مطابقت داشت). فشار همچنان افزایش می‌یابد و ضخامت لایه ژل افزایش می‌یابد و پروتئین باقی‌مانده روی سطح غشاء افزایش می‌یابد و در نتیجه میزان ماندگاری پایینی دارد. به منظور اطمینان از اثر جداسازی غشا، پارامتر فشار عملیاتی بهینه 0.07MPa است.

2.2.2 اثر دما بر میزان احتباس پروتئین

تحت شرایط فشار {{0}}.11MPa، pH 9.0، تأثیر دماهای مختلف (25 درجه، 30 درجه، 35 درجه، 40 درجه و 45 درجه) را بر حفظ پروتئین مطالعه کنید. نتایج در شکل زیر نشان داده شده است.

 

همانطور که در شکل بالا نشان داده شده است، با افزایش دما، میزان ماندگاری غشای اولترافیلتراسیون به تدریج افزایش می یابد و در دمای 45 درجه به حداکثر می رسد که میزان ماندگاری 97.01٪ است. از آنجایی که ویسکوزیته کلاژن ارتباط نزدیکی با دما دارد: هنگامی که دما پایین‌تر است، ویسکوزیته کلاژن بزرگ‌تر می‌شود و در نتیجه کلاژن به راحتی روی سطح غشاء مقاومت ایجاد می‌کند و در نتیجه میزان ماندگاری پایینی دارد. هنگامی که دما افزایش می یابد، ویسکوزیته کلاژن کاهش می یابد و برهمکنش بین مولکول های کلاژن ضعیف می شود، به طوری که سرعت انتقال جرم افزایش می یابد و قطبش غلظت ضعیف می شود و در نتیجه میزان احتباس افزایش می یابد. یکی دیگر از دلایل افزایش میزان ماندگاری این است که دما افزایش می‌یابد و حلالیت کلاژن به همان نسبت افزایش می‌یابد و پدیده مسدود شدن کلاژن غشا کاهش می‌یابد. بنابراین دمای بهینه برای اولترافیلتراسیون 45 درجه است.

2.2.3 اثر pH بر حفظ پروتئین

تحت شرایط فشار {{0}}.11MPa و دمای 40 درجه، اثرات شرایط pH مختلف، یعنی pH=6 را مطالعه کنید.0، pH{ {5}}.{{10}}، pH=8.0، pH=9.0 و pH=10.0، بر میزان ماندگاری . نتایج در شکل زیر نشان داده شده است.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7، میزان ماندگاری به تدریج با افزایش pH افزایش می یابد. این به این دلیل است که غشای اولترافیلتراسیون غشای افرای پلی اتر با بار منفی، کلاژن با بار منفی در شرایط قلیایی، مولکول های کلاژن با بار منفی و غشای اولترافیلتراسیون با همان بار یک حالت منحصر به فرد را تشکیل می دهند، به طوری که مولکول های کلاژن به راحتی روی سطح باقی نمی مانند. از غشا، مسدود کردن غشا آسان نیست، بنابراین pH بهینه اولترافیلتراسیون 8-10 است.

2.3 بهینه سازی فرآیند اولترافیلتراسیون و اعتبارسنجی نتایج

تجزیه و تحلیل توسط Design-Expert8.05 نرم افزار نشان می دهد که پارامترهای فرآیند بهینه به شرح زیر است: فشار کاری 0.14MPa، دمای کاری 40.98 درجه و pH محلول=9.43. در این شرایط، نرخ نگهداری 92.551 درصد بود. با در نظر گرفتن عملکرد پارامترهای واقعی، فشار عملیاتی 0.14MPa، دمای عملیاتی 40 درجه و مقدار pH مایع خوراک در شرایط اولترافیلتراسیون 9.50 است. تأیید آزمایشی پس از شروع پایداری سیستم دستگاه اولترافیلتراسیون آغاز می شود. نتیجه نرخ نگهداری به دست آمده (92.{17}}.1)% (n=3) است. مقدار پیش‌بینی‌شده معادله اساساً مشابه مقدار اندازه‌گیری شده است، که نشان می‌دهد نتیجه پارامتر شرطی پیش‌بینی‌شده مطابق با نتیجه شرطی واقعی است.

2.4 نتایج آنالیز الکتروفورز

کلاژن خالص شده توسط الکتروفورز SDS-PAGE آنالیز می شود و نتایج در شکل زیر نشان داده شده است.

همانطور که در شکل بالا نشان داده شده است، خط 1 کلاژن خالص شده در این آزمایش و خط 2 نمونه کلاژن استاندارد تاندون ساق پا می باشد. از الکتروفورز SDS-PAGE می توان دریافت که پروتئین کلاژن پیشنهادی در این آزمایش می تواند به عنوان کلاژن شناسایی شود، اما مرزهای به ظاهر نامشخص زنجیره پپتیدی a1 و زنجیره پپتیدی a2 مشخص نیست. از الکتروفورز مشخص است که هیچ باند پروتئین دیگری وجود ندارد و می توان نتیجه گرفت که خلوص کلاژن خالص شده بالا است.