کاربرد اولترافیلتراسیون در استخراج طبیعی کلاژن

کلاژن به عنوان یک منبع پروتئین طبیعی دارای زیست سازگاری خوب، آنتی ژنی کم، تجزیه پذیری زیستی و هموستاز، ساختار مارپیچ محکم و ویژگی های خاص خود است که همه اینها پیش نیازهای صنعتی شدن آن را فراهم می کند. کلاژن و فرآورده های جانبی آن نه تنها به عنوان مواد بسته بندی، لوازم آرایشی و بهداشتی، بلکه به عنوان افزودنی های غذایی برای بهبود فرآورده های گوشتی استفاده می شود و نقش مهمی به ویژه در زمینه پزشکی ایفا می کند.

 

کلاژن چیست؟?

 

کلاژن یک ماکرومولکول بیولوژیکی، جزء اصلی بافت همبند حیوانی و فراوان ترین و پراکنده ترین پروتئین عملکردی در پستانداران است که 25 تا 30 درصد کل پروتئین و حتی تا 80 درصد یا بیشتر در برخی از موجودات زنده را تشکیل می دهد. نقش بافت پیوندی در سلول های حیوانی را ایفا می کند.

اندازه گیری می شود که بدن یک بزرگسال حدود 3 کیلوگرم کلاژن دارد که عمدتاً در پوست انسان، استخوان ها، چشم ها، دندان ها، تاندون ها، اندام های داخلی (از جمله قلب، معده، روده ها، رگ های خونی) و سایر قسمت های بدن انسان وجود دارد. عملکرد آن حفظ مورفولوژی و ساختار پوست و بافت ها و اندام ها است و همچنین ماده خام مهمی برای ترمیم بافت های مختلف پس از آسیب است.

 

انواع مختلفی از پروتئین کلاژن وجود دارد و انواع رایج آن عبارتند از نوع I، نوع II، نوع III، نوع V و XI. به دلیل زیست سازگاری خوب، زیست تخریب پذیری و زیست فعالی، کلاژن به طور گسترده در مواد غذایی، پزشکی، مهندسی بافت، آرایشی و بهداشتی و سایر زمینه ها استفاده شده است.

نحوه استخراج کلاژن طبیعی

بافت های حیوانی دام و طیور راه اصلی مردم برای به دست آوردن کلاژن طبیعی و پپتیدهای کلاژن آن است. با این حال، به دلیل بیماری های حیوانی مرتبط و اعتقادات مذهبی خاص، استفاده مردم از کلاژن و فرآورده های آن از پستانداران خشکی محدود شده است و توسعه به تدریج به سمت موجودات دریایی می رود. سازمان ایمنی غذای اروپا (EFSA) تایید کرده است که حتی کلاژن مشتق شده از استخوان حیوانات نیز پتانسیل ابتلا به بیماری جنون گاوی و سایر بیماری های مرتبط را ندارد. به دلیل تفاوت در ترکیب اسیدهای آمینه و درجه اتصال عرضی، حیوانات آبزی، به ویژه کلاژن غنی از مواد زائد فرآوری آنها مانند پوست، استخوان و فلس، مزایای زیادی دارند که کلاژن دام از آن بی بهره است. علاوه بر این، کلاژن مشتق شده از حیوانات دریایی به وضوح از کلاژن حیوانات خشکی از برخی جنبه ها برتر است، مانند آنتی ژنی کم و کم حساسیت. بنابراین، کلاژن آبزی ممکن است به تدریج جایگزین کلاژن حیوانات خشکی شود. فرآیند استخراج کلاژن از فلس ماهی کپور علف به عنوان مثال در نظر گرفته شد.

 

استخراج کلاژن از فلس های ماهی کپور علف به روش اولترافیلتراسیون

1. مواد و روش ها

1.1 نمونه آزمایشی

عصاره آبی کلاژن خام.

1.2 روش های آزمایش

1.2.1 مسیر فرآیند اولترافیلتراسیون

 

1.2.2 تعیین فرآیند قبل از فیلتراسیون

در این آزمایش، روش فیلتراسیون خلاء و روش میکروفیلتراسیون با یکدیگر مقایسه و تجزیه و تحلیل می شوند تا بهترین فرآیند فیلتراسیون قبل از فیلتراسیون مشخص شود. روش های ویژه آزمون به شرح زیر است:

① عصاره آب کلاژن خام با پمپاژ خلاء کاغذ صافی فیلتر شد تا ذرات معلق و ناخالصی های موجود در عصاره آب حذف شود.

② عصاره آب کلاژن خام توسط غشای میکروفیلتراسیون 0.2μm فیلتر شد تا مواد نامحلول و ناخالصی های موجود در عصاره آب حذف شود.

 

1.2.3 انتخاب اندازه منافذ غشاء اولترافیلتراسیون

اندازه منافذ غشاء اولترافیلتراسیون 100 کیلو دالتون بود.

 

1.2.4 آزمایش تک عاملی فرآیند تصفیه اولترافیلتراسیون

فناوری اولترافیلتراسیون برای خالص‌سازی عصاره آب کلاژن خام استفاده شد و آزمایش‌های تک عاملی بر روی تأثیر فشار عملیاتی، دمای عملیاتی و مقدار pH بر حفظ کلاژن مورد مطالعه قرار گرفت. پس از راه اندازی تجهیزات اولترافیلتراسیون برای مدتی و تثبیت، تأثیر عوامل مختلف بر حفظ کلاژن مورد مطالعه قرار گرفت.

 

1.2.5 فرمول محاسبه

 

2. نتایج و تجزیه و تحلیل

2.1 نتایج تجزیه و تحلیل فرآیند پیش فیلتراسیون

نتایج مقایسه دو روش فیلتراسیون استخراج خلاء و میکروفیلتراسیون در جدول زیر نشان داده شده است.

 

از جدول می توان دریافت که هم روش فیلتراسیون خلاء و هم روش میکروفیلتراسیون می توانند ناخالصی ها و جامدات نامحلول موجود در محلول را حذف کنند، اما روش میکروفیلتراسیون اثر محافظتی بهتری بر روی پروتئین ها دارد، یعنی اتلاف آن مشخص نیست و روش فیلتراسیون خلاء به راحتی باعث از دست دادن پروتئین می شود. علاوه بر این، روش فیلتراسیون خلاء پس از قرار دادن فیلتر برای مدتی کدورت به نظر می رسد و میکروفیلتر هنوز شفاف و شفاف است، بنابراین میکروفیلتراسیون به عنوان فرآیند پیش تصفیه اولترافیلتراسیون انتخاب می شود.

 

2.2 تست تک عاملی فرآیند اولترافیلتراسیون

2.2.1 تأثیر فشار اولترافیلتراسیون بر میزان ماندگاری

تحت شرایط دمای 40 درجه و pH=9.0، تأثیر فشارهای مختلف اولترافیلتراسیون (0.07MPa، {{9} }.{11}}9MPa، 0.11MPa، 0.13MPa و 0.15MPa) روی حفظ پروتئین مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج در شکل زیر نشان داده شده است.

همانطور که از شکل بالا مشخص است، با افزایش فشار عملیاتی، میزان ماندگاری پروتئین به تدریج کاهش می یابد. وقتی فشار عملیاتی {{0}} باشد.07MPa، میزان حفظ پروتئین 96.53% است و زمانی که فشار کاری 0.15MPa باشد، میزان حفظ پروتئین 84.38% است. این به این دلیل است که اثر جداسازی اولترافیلتراسیون روی مواد توسط اختلاف فشار انجام می شود. در محدوده فشار کاری کم، مولکول های کوچک می توانند به سرعت از غشاء عبور کنند، در حالی که مولکول های بزرگ می توانند توسط غشای اولترافیلتراسیون به دام افتاده و روی سطح غشاء جمع شوند. در این زمان، سطح غشاء و عصاره آب اختلاف غلظت ایجاد می‌کنند و در نتیجه مقاومت قطبش غلظت ایجاد می‌شود. در این زمان، فشار نسبتاً کم است و نمی تواند تأثیر زیادی بر میزان ماندگاری داشته باشد. اما با افزایش فشار، مقاومت قطبش غلظت به تدریج افزایش می یابد و اختلاف غلظت بین سطح غشا و عصاره آب به تعادل می رسد. هنگامی که فشار از این تعادل فراتر رود، یک لایه ژل می تواند بر روی سطح غشاء تشکیل شود (که با این تئوری که قطبش غلظت و لایه تراکم در طول اولترافیلتراسیون تشکیل می شود مطابقت دارد) و فشار همچنان افزایش می یابد، ضخامت لایه ژل افزایش می یابد. و پروتئین باقی مانده در سطح غشاء نیز افزایش می یابد. این منجر به نرخ نگهداری کمتر می شود. به منظور اطمینان از اثر جداسازی غشا، پارامتر بهینه فشار عملیاتی 0.07MPa است.

 

2.2.2 تأثیر دما بر حفظ پروتئین

تحت شرایط فشار {0}}.11MPa و pH=9.0، تأثیر دماهای مختلف یعنی 25 درجه، 30 درجه، 35 درجه، 40 درجه و 45 درجه بر پروتئین حفظ مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج در شکل زیر نشان داده شده است.

همانطور که از شکل بالا مشاهده می شود، میزان ماندگاری غشای اولترافیلتراسیون به تدریج با افزایش دما افزایش می یابد و در دمای 45 درجه با نرخ ماندگاری 01/97 درصد به حداکثر می رسد. این به این دلیل است که ویسکوزیته کلاژن ارتباط نزدیکی با دما دارد. هنگامی که دما پایین است، ویسکوزیته کلاژن بزرگتر می شود و تجمع کلاژن در سطح غشاء به راحتی مقاومت ایجاد می کند و در نتیجه میزان احتباس کم می شود. با افزایش دما، ویسکوزیته کلاژن کاهش می‌یابد، برهمکنش بین مولکول‌های کلاژن ضعیف می‌شود و سرعت انتقال جرم افزایش می‌یابد، پدیده قطبش غلظت ضعیف می‌شود و نرخ احتباس افزایش می‌یابد. دلیل دیگر افزایش میزان ماندگاری این است که دما افزایش می یابد، حلالیت کلاژن نیز به همان نسبت افزایش می یابد و پدیده مسدود شدن کلاژن غشا کاهش می یابد، بنابراین دمای بهینه اولترافیلتراسیون 45 درجه است.

 

2.2.3 تأثیر مقدار pH بر حفظ پروتئین

تحت شرایط {{0}}.11MPa فشار و دمای 40 درجه، تأثیر شرایط pH مختلف، یعنی pH=6.0، pH{{ 5}}.{{10}}، pH=8.0، pH=9.0 و pH=10.0، بر میزان ماندگاری مطالعه شد. نتایج در شکل زیر نشان داده شده است.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7، میزان ماندگاری به تدریج با افزایش مقدار pH افزایش می یابد. این به این دلیل است که غشای اولترافیلتراسیون غشای افرا پلی اتر با بار منفی است و کلاژن در شرایط قلیایی بار منفی دارد. مولکول های کلاژن با بار منفی با غشای اولترافیلتراسیون با همان بار یک حالت انحصاری متقابل ایجاد می کنند، بنابراین مولکول های کلاژن به راحتی روی سطح غشا باقی نمی مانند و غشا را مسدود نمی کنند. بنابراین مقدار pH بهینه اولترافیلتراسیون 8-10 است.

 

2.3 بهینه سازی فرآیند اولترافیلتراسیون و تأیید نتایج

با توجه به تجزیه و تحلیل نرم افزار Design-Expert8.05 نرم افزار، پارامترهای فرآیند بهینه عبارتند از: فشار کاری 0.14MPa، دمای کاری 40.98 درجه، pH محلول{{7 }}.43، و نرخ حفظ 92.551٪ است. با در نظر گرفتن عملکرد پارامترهای واقعی، شرایط اولترافیلتراسیون به عنوان فشار عملیاتی 0.14MPa، دمای عملیاتی 40 درجه و مقدار pH محلول ماده 9.50 انتخاب شد و تأیید آزمایش پس از راه‌اندازی و تثبیت سیستم اولترافیلتراسیون آغاز شد. نتیجه میزان ماندگاری (1/0±61/92) درصد (n{20}}) بود. مقادیر پیش‌بینی‌شده معادله اساساً مشابه مقادیر اندازه‌گیری شده است، که نشان می‌دهد نتایج پارامتر شرایط پیش‌بینی‌شده با نتایج شرایط واقعی مطابقت دارد.

 

2.4 نتایج آنالیز الکتروفورتیک

کلاژن خالص شده توسط الکتروفورز SDS-PAGE آنالیز شد و نتایج در شکل زیر نشان داده شده است.

 

همانطور که از شکل بالا مشاهده می شود، خط 1 کلاژن خالص شده این آزمایش است و خط 2 نمونه کلاژن استاندارد تاندون ساق پا است. از الکتروفورز SDS-PAGE می توان دریافت که کلاژن در این مطالعه را می توان به عنوان کلاژن شناسایی کرد، اما به نظر می رسد مرزهای بین زنجیره پپتیدی a1 و زنجیره پپتیدی a2 مشخص نیست. از نقشه الکتروفورتیک می توان دریافت که هیچ ناخالصی پروتئین دیگری وجود ندارد، بنابراین می توان نتیجه گرفت که کلاژن خالص شده خلوص بالایی دارد.

درباره هدایت

 

Guidling Technology یک شرکت ملی با فناوری پیشرفته است که بر روی بیوداروها، کشت سلولی، تصفیه و غلظت زیست پزشکی، تشخیص و مایعات صنعتی تمرکز دارد. ما دستگاه‌های فیلتر گریز از مرکز، کاست‌های اولترافیلتراسیون و میکروفیلتراسیون، فیلتر ویروس، سیستم TFF، فیلتر عمق، فیبر توخالی و غیره را با موفقیت توسعه داده‌ایم. غشاها و فیلترهای غشایی ما به طور گسترده در غلظت، استخراج و جداسازی پیش فیلتراسیون، میکروفیلتراسیون، اولترافیلتراسیون و نانوفیلتراسیون استفاده می شوند. خطوط تولید متعدد ما، از فیلتراسیون آزمایشگاهی کوچک و یکبار مصرف گرفته تا سیستم های فیلتراسیون تولید، آزمایش عقیم سازی، تخمیر، کشت سلولی و موارد دیگر، نیازهای آزمایش و تولید را برآورده می کند. Guidling Technology مشتاقانه منتظر همکاری با شما است!