فرآیند تغلیظ اولترافیلتراسیون/دیافیلتراسیون پایین دست: چگونه به طور موثر از نفوذ و از دست دادن پروتئین هدف جلوگیری کنیم

فرآیند غلظت اولترافیلتراسیون/دیافیلتراسیون پایین دست: چگونه به طور موثر از نفوذ و از دست دادن پروتئین هدف جلوگیری کنیم

در فرآیندهای تصفیه پایین‌دستی برای پروتئین‌های نوترکیب، فرآورده‌های خونی و سایر مواد بیولوژیک، از اولترافیلتراسیون/دیافیلتراسیون (UF/DF) برای غلظت مواد اولیه، تبادل بافر و حذف نمک‌ها و ناخالصی‌های مولکولی کوچک استفاده می‌شود. جداسازی بر اساس غربال غشایی انجام می‌شود: مولکول‌های بزرگ مانند آنتی‌بادی‌های مونوکلونال (mAbs) توسط غشاء حفظ می‌شوند، در حالی که نمک‌ها، اندوتوکسین‌ها، پروتئین‌های سلول میزبان آزاد (HCPs) و سایر ناخالصی‌های مولکولی کوچک از غشاء عبور می‌کنند و در تراوش حذف می‌شوند. در طی افزایش مقیاس{4}}فرآیند، از دست دادن پروتئین هدف از طریق غشاء به آسانی رخ می‌دهد و مستقیماً بازده را کاهش می‌دهد و هزینه‌های دسته‌ای را افزایش می‌دهد. در برخی از شرایط عملیاتی، پروتئین ممکن است در تراوش شناسایی شود، که نیاز به تعیین سریع این موضوع دارد که آیا اجزای نشت‌شده، mAb هدف دست نخورده، دانه‌های تجزیه شده/تکه‌شده، یا پروتئین‌های سلول میزبان هستند. این مقاله به دو بخش عمده تقسیم می‌شود: رویکردهای کنترلی سنتی{7}}فرآیند را بررسی می‌کند و در ترکیب با طراحی آزمایش‌ها (DOE)، یک پنجره فرآیند قوی ایجاد می‌کند که توسط روش‌های تحلیلی متعدد برای تعیین هویت پروتئین‌های شناسایی‌شده در تراوش پشتیبانی می‌شود.

 

 

I. علل کلیدی نفوذ پروتئین هدف از طریق غشاء در طول UF/DF

1. فشار بیش از حد غشایی (TMP)
هنگامی که اختلاف فشار در سراسر غشاء بسیار زیاد است، کشش حلال افزایش می‌یابد و مقداری پروتئین مونومر را مجبور می‌کند به داخل تراوا وارد شود. در حین افزایش -، مخزن تغذیه حاوی حجم بیشتری از مواد است و نوسانات فشار در لوله‌کشی بارزتر است، که احتمال افزایش فشار گذرا را بیشتر از مقیاس آزمایشگاهی می‌کند.

2. نرخ جریان مماسی نامناسب
اگر سرعت جریان خیلی کم باشد، یک لایه پلاریزاسیون متراکم- روی سطح غشاء تشکیل می‌شود و غلظت پروتئین محلی ممکن است از آستانه تحمل غشا فراتر رود. اگر سرعت جریان خیلی زیاد باشد، تنش برشی ممکن است باعث شکاف ساختاری mAb شود و قطعات پروتئینی کوچک‌تری تولید کند که می‌توانند آزادانه از منافذ غشایی عبور کنند.

3. غلظت بیش از حد پروتئین در ماده اولیه
هنگامی که غلظت پروتئین در خوراک بیش از حد بالا باشد، پروتئین در سطح غشاء تجمع می یابد و ممکن است مقداری پروتئین مونومر به داخل تراوش منتقل شود. این یک مشکل رایج در تولید-مقیاس بزرگ است.

4. pH یا هدایت خارج از محدوده فرآیند
تغییرات در ویژگی های بار پروتئین می تواند شعاع هیدراتاسیون و اندازه ذرات ظاهری آن را کاهش دهد و در نتیجه نفوذ غیرعادی غشاء ایجاد کند.

5. پیری کاست غشاء، شار انتشاری بالا، یا پیش{1}}تهویه ناکافی
نقص‌های فیزیکی در کاست غشایی می‌تواند مستقیماً باعث نشت پروتئین شود و یک خطر مرتبط{0}}تجهیزات را نشان دهد. CIP مکرر با محلول های قلیایی قوی می تواند به تدریج به مواد غشایی پلی اتر سولفون (PES) آسیب برساند.

6. حجم دیافیلتراسیون بیش از حد
در طول دیافیلتراسیون طولانی مدت، شستشوی مداوم با حلال می تواند به تدریج مقادیر کمی از پروتئین مونومر را از بین ببرد.

 

II. اقدامات عملی سنتی برای جلوگیری از نفوذ و از دست دادن پروتئین هدف

(الف) کنترل پارامتر فرآیند

1. کنترل فشار غشایی (TMP)
یک حد هشدار فشار بالایی را تعریف کنید و هشدارهای اینترلاک را برای جلوگیری از تأثیرات گذرا فشار{0} روی لایه غشاء ایجاد کنید. پس از تعیین پارامترهای خط پایه در مقیاس کوچک، فشار عملیات ایمن را در حین تولید مقیاس{2}} کاهش دهید و محدوده تحمل فرآیند مناسب را رزرو کنید.

2. نرخ جریان متقاطع را بهینه کنید
ایجاد یک لایه مرزی پایدار و کاهش قطبش غلظت در سطح غشاء از طریق جریان متقاطع، در نتیجه تجمع پروتئین در سطح غشاء در منبع به حداقل می رسد.

3. غلظت نهایی را پس از تغلیظ محدود کنید
بر اساس خواص فیزیکوشیمیایی پروتئین، حد غلظت تعیین کنید و از غلظت بیش از حد خوراک خودداری کنید. برای mAbs، غلظت نهایی معمول به طور کلی از 50 میلی گرم در میلی لیتر تجاوز نمی کند. برای برخی از mAbهای مستعد تجمع{2}، غلظت باید بیشتر کاهش یابد.

4. pH خوراک و رسانایی را کنترل کنید
اندازه ذرات هیدراته پروتئین را ثابت نگه دارید و از انقباضات مولکولی ناشی از اختلالات قدرت-اسید/باز یا یونی اجتناب کنید.

(ب) تجهیزات و کنترل های عملیاتی

1. آزمایش یکپارچگی کاست غشایی را قبل از هر دسته انجام دهید
قبل از تولید هر دسته، یک آزمایش نقطه حباب-برای شناسایی الیاف غشا شکسته انجام دهید. کاست های غشایی آسیب دیده باید فوراً دور ریخته شوند تا از نشت مداوم پروتئین جلوگیری شود.

2. روش تمیز کردن CIP را استاندارد کنید
غلظت NaOH و زمان تماس را کنترل کنید. پس از تمیز کردن شدید قلیایی، مواد غشا را به طور کامل متعادل کنید تا خطر تغییر شکل منافذ غشا را کاهش دهید.

3. از دیافیلتراسیون مرحله ای استفاده کنید
از یک تبادل بافر با حجم زیاد در مراحل اولیه برای حذف نمک استفاده کنید و با نزدیک شدن به نقطه پایانی، سرعت جریان دیافیلتراسیون را کاهش دهید تا کشش و از دست دادن پروتئین کاهش یابد.

 

III. ایجاد فضای طراحی فرآیند از طریق DOE (شخصیت‌بندی فرآیند QbD؛ قابل استفاده برای ارسال IND)

1. غربالگری فاکتور
پنج پارامتر اصلی فرآیند UF/DF (P): فشار غشایی، سرعت جریان خوراک، غلظت اولیه پروتئین، pH خوراک و دمای عملیاتی را بررسی کنید.
متغیرهای پاسخ: بازده حفظ شده، محتوای پروتئین در تراوش، شار غشایی، و درصد دانه‌های با وزن مولکولی بالا.

از طریق تجزیه و تحلیل اهمیت، عوامل کلیدی که در نشت پروتئین نقش دارند را شناسایی کنید.

2. مدل سازی سطح پاسخ
چهار پارامتر با بالاترین اهمیت را برای ساختن سطح پاسخ و تجزیه و تحلیل تعاملات بین پارامترها انتخاب کنید. تحت بسیاری از شرایط عملیاتی، یک پارامتر واحد ممکن است در محدوده واجد شرایط خود باقی بماند، در حالی که ترکیب دو پارامتر می تواند منجر به نفوذ پروتئین شود. چنین اثرات متقابلی را نمی‌توان از طریق یک-عامل-در{4}}یک-زمان آزمایش‌های سنتی شناسایی کرد. بر اساس مدل، یک فضای طراحی قابل اجرا تعریف کنید. تا زمانی که پارامترهای فرآیند در این محدوده باقی می مانند، حفظ پروتئین موثر می تواند تضمین شود در حالی که ناخالصی ها با دیافیلتراسیون حذف می شوند.

3. بدترین-چالش موردی (برای شناسایی فرآیند لازم است)
پارامترهای فرآیند را در انتهای مرزهای عملیاتی برای شبیه‌سازی تنوع تولید انتخاب کنید: حداکثر TMP، حداقل سرعت جریان متقاطع، و{0}}غلظت پروتئین حد بالا. بررسی کنید که حتی در شرایط عملیاتی شدید،-از دست دادن پروتئین هدف در مقیاس بزرگ رخ نمی‌دهد و در نتیجه الزامات بررسی CMC را برآورده می‌کند.

 

IV. روش‌های تحلیلی متعدد برای شناسایی پروتئین‌های شناسایی‌شده در نفوذ و تشخیص mAb هدف، قطعات تخریب و HCP

بر اساس کارایی تحلیلی، هزینه و سناریوهای ارسال نظارتی، روش ها را می توان به دو دسته تقسیم کرد: غربالگری سریع و آزمایش تاییدی. روش‌های سریع باید برای نظارت معمول فرآیند اولویت‌بندی شوند. هنگامی که انحرافات غیر طبیعی رخ می دهد، باید از روش های شناسایی دقیق استفاده شود.

1. اسپکتروفتومتری UV (غربالگری آنلاین سریع؛ ترجیحاً برای نظارت معمولی فروشگاه-طبقه)
تراوش را جمع آوری کرده و میزان جذب A280 آن را اندازه گیری کنید. این فقط می تواند تعیین کند که آیا پروتئین در تراوا وجود دارد و نمی تواند گونه های پروتئین را تشخیص دهد. این عمدتا برای نظارت بر روند معمول استفاده می شود. افزایش مداوم مقدار A280 نشان دهنده بدتر شدن نشت پروتئین است و نیاز به تعلیق فوری دیافیلتراسیون و بررسی فرآیند دارد.

2. SDS{1}}الکتروفورز PAGE (متداول ترین روش شناسایی کیفی مورد استفاده)
از الکتروفورز کاهنده و غیرکاهنده-استفاده کنید و موقعیت‌های باند را با موقعیت‌های mAb هدف در مواد اولیه مقایسه کنید:
1) اگر موقعیت باند کاملاً مطابق با mAb هدف باشد، mAb دست نخورده در غشا نفوذ کرده است.
2) اگر نوارهای-مولکولی- با وزن کمتر ظاهر شوند، پروتئین دچار شکاف هیدرولیتیک شده و قطعات mAb تولید می‌کند.
3) اگر باندها با چندین نوار متفرقه پراکنده شده باشند، بیشتر آنها پروتئین های سلول میزبان (HCPs) از سلول های میزبان E. coli/CHO هستند تا محصول هدف.

3.-اندازه عملکرد بالا-کروماتوگرافی استثنایی (HPSEC)
اجزا را بر اساس اندازه مولکولی جدا کنید و زمان شستشوی آنها را با کروماتوگرام مواد اولیه مقایسه کنید:
- یک پیک اصلی با زمان ماند مشابه با mAb نشان دهنده پروتئین هدف دست نخورده است.
- یک پیک که زودتر شسته می‌شود، نشان‌دهنده وزن‌های-مولکولی-قطعات بالا است.
- یک پیک که بعداً شسته می‌شود، قطعات تخریب مولکولی- کم وزن را نشان می‌دهد.
- عدم وجود یک پیک اصلی مشخصه پروتئین ناخالصی HCP را نشان می‌دهد.
این روش می تواند داده های کمی ارائه دهد و می تواند در گزارش های بررسی انحراف فرآیند گنجانده شود. در مواد ارسالی بالینی از مقبولیت بالایی برخوردار است.

4. آزمایش کیت الایزا پروتئین سلول میزبان HCP
اگر پروتئین در تراوش تشخیص داده شود، نتیجه ELISA افزایش می‌یابد و HPSEC هیچ پیک مشخصه‌ای را نشان نمی‌دهد، ماده نشت‌شده اساساً می‌تواند پروتئین‌های سلول میزبان CHO- باشد. این نشان دهنده حذف ناقص ناخالصی در طی تصفیه بالادست است. ناخالصی ها در مرحله UF/DF شسته می شوند و نشان دهنده از بین رفتن محصول نیستند.

5. تأیید کروماتوگرافی میل ترکیبی (کروماتوگرافی پروتئین A)
پروتئین A به طور خاص به ناحیه Fc mAbs متصل می شود. نمونه تراوا را روی ستون بارگذاری کنید: ظاهر یک پیک شستشوی مشخصه نشان دهنده وجود آنتی بادی هدف دست نخورده است. عدم وجود یک پیک شستشو نشان می دهد که پروتئین های موجود در تراوش همه پروتئین های ناخالصی هستند.

6. طیف سنجی جرمی (LC-MS) (در-قابلیت ردیابی عمیق، برای بررسی انحرافات فرآیند اصلی استفاده می شود)
LC{0}}MS می‌تواند مستقیماً توالی اسید آمینه را تجزیه و تحلیل کند و منشاء پروتئین را دقیقاً تعیین کند. این عمدتا برای بررسی انحرافات دشوار یا غیر معمول استفاده می شود و به عنوان یک روال در آزمون کنترل فرآیند استفاده نمی شود.

V. اقدامات اصلاحی مربوط به نتایج تحلیلی مختلف

1. mAb هدف دست نخورده در تراوش شناسایی شده است
کاهش فشار گذرنده و غلظت نهایی پس از غلظت. محدود کردن محدوده عملیاتی فرآیند بر اساس نتایج DOE. و یکپارچگی کاست غشا را بررسی کنید.

2. قطعات تجزیه آنتی بادی در تراوش شناسایی شده است
بررسی تنش برشی در طول فرآیند و pH شدید. بهینه سازی مرحله غیرفعال سازی ویروسی بالادست برای کاهش شکاف پروتئین.

3. فقط پروتئین های ناخالص HCP در تراوش شناسایی شده است
نیازی به تنظیم پارامترهای UF/DF نیست. مشکل را به مراحل کروماتوگرافی قبلی ردیابی کنید و حذف ناخالصی را در طول کروماتوگرافی میل ترکیبی و تبادل یونی- بهبود بخشید.

 

VI. خلاصه

برای جلوگیری از نشت پروتئین در طول UF/DF، کنترل فرآیند سنتی به تجربه تاریخی برای تعریف پارامترهای نقطه‌ای تکیه می‌کند، که فقط می‌تواند به اندازه کافی به تولید{0}در مقیاس کوچک پایدار رسیدگی کند. برای حصول اطمینان از عملکرد پایدار در طی مقیاس فرآیند گام به گام-بالا، باید از توصیف فرآیند مبتنی بر DOE- برای ایجاد فضای طراحی فرآیند با تحمل کافی استفاده شود. کنترل پارامتر مبتنی بر فاصله{5}}می تواند تغییرپذیری تولید را جبران کند. هنگامی که پروتئین در تراوا شناسایی شد، یک سیستم تشخیص UV ساده می‌تواند یک هشدار اولیه و به دنبال آن الکتروفورز، HPSEC و ELISA برای ردیابی و شناسایی ارائه دهد. این امکان تمایز دقیق بین محصول هدف و ناخالصی‌های سلول میزبان را فراهم می‌کند، و امکان بررسی و اقدامات اصلاحی هدفمند ریشه-را فراهم می‌کند. این نیز یک مؤلفه تحقیقاتی استاندارد است که در حال حاضر در اسناد CMC برای پروژه‌های mAb گنجانده شده است.