نحوه انتخاب لوله اولترافیلتراسیون مناسب

لوله های اولترافیلتراسیون که معمولاً برای غلظت پروتئین و جایگزینی بافر استفاده می شوند اغلب در لوله های اولترافیلتراسیون استفاده می شوند. مدل‌های دیگری نیز وجود دارند که بسته به وزن مولکولی پروتئین هدف، حجم قبل از غلظت و حجم غلظت هدف، اندازه‌های حجمی و لوله‌های اولترافیلتراسیون متفاوتی دارند. قابل استفاده مجدد

1. یک لوله اولترافیلتراسیون مناسب را انتخاب کنید، عمدتاً با در نظر گرفتن MWCO و حجم غلظت. به طور کلی، وزن مولکولی نباید بیشتر از 1/3 وزن مولکولی پروتئین مورد نظر باشد. اگر وزن مولکولی پروتئین مورد نظر حدود 10 کیلو دالتون باشد، می توان از یک لوله اولترافیلتراسیون با وزن مولکولی حفظ شده 3 کیلو دالتون استفاده کرد.

2. اولترافیلتراسیون تازه خریداری شده خشک است. قبل از استفاده، یک میلی‌لیک آب اضافه کنید. آب به طور کامل از غشا عبور می کند و برای چند دقیقه در یک حمام یخ یا یخچال قرار می گیرد. سپس آب را بیرون بریزید تا محلول پروتئین اضافه شود. مقدار محلول پروتئین نباید از خط سفید بالای لوله آزمایش تجاوز کند. عملیات آسان. قبل از افزودن محلول پروتئین، لوله اولترافیلتراسیون باید برای خنک شدن قبل در داخل یخ قرار داده شود.

3. تعادل. جرم و مرکز ثقل باید متعادل باشد. توجه داشته باشید که سرعت و شتاب نباید خیلی سریع باشد، در غیر این صورت غشای اولترافیلتراسیون مستقیماً آسیب می بیند. اولترافیلتراسیون گریز از مرکز را شروع کنید (سانتریفیوژ را تا 4 درجه از قبل خنک کنید). جهت دیافراگم و محور چرخان را می توان طبق دستورالعمل تنظیم کرد (در مورد سانتریفیوژ زاویه، دیافراگم عمود بر محور است). در استفاده واقعی، سرعت کلی کمتر از سرعت مشخص شده در دفترچه راهنما است که ممکن است عمر مفید لوله گریز از مرکز را افزایش دهد.

4. هنگامی که به 1 میلی لیتر باقیمانده تغلیظ شد، [محلول 50 لیتری برادفورد خانگی را بردارید، 10 لیتر مایع به آن اضافه کنید تا ببینید آبی می شود یا خیر، و تعیین کنید که آیا لوله اولترافیلتراسیون پروتئین را نشت می کند یا خیر. اگر لوله نشتی داشت، آن را در لایه بالایی بریزید و سپس به لوله جدید برگردید تا اولترافیلتراسیون شروع شود. برای تعیین دقیق نشتی لوله آزمایش، لطفاً 5 میلی گرم 10 دقیقه سانتریفیوژ را به مدت 10 دقیقه انجام دهید، سپس آن را عبور دهید، ژل پروتئین یا برادفورد را اجرا کنید [اندازه گیری درشت]. به افزودن محلول پروتئین باقیمانده برای تغلیظ (برای جلوگیری از گرم شدن پروتئین روی یخ عمل کنید) تا زمانی که تمام محلول های غلیظ اضافه شوند، ادامه دهید. در حین سانتریفیوژ، توجه داشته باشید که آیا رسوب پروتئین رخ می دهد و باعث انسداد لوله می شود. اگر بارش رخ داد، لطفاً علت خاص بارش را مشخص کنید، آیا غلظت پروتئین خیلی زیاد است یا اینکه بافر نامناسب است. اولی را می توان با استفاده از چندین لوله اولترافیلتراسیون به طور همزمان برای کاهش غلظت حل کرد، در حالی که دومی می تواند بافرهای مختلف را تا زمانی که پروتئین رسوب کند تغییر دهد.

5. مراحل قبلی برای تغلیظ پروتئین استفاده می شود. اگر قرار است بافر جایگزین شود، وقتی محلول پروتئین کل تا حدود 1 میلی لیتر غلیظ شد، به آرامی یک بافر جدید اضافه کنید (اولترافیلتراسیون از طریق غشای اولترافیلتراسیون 0.22um)، و سپس به مدت سه بار به طور مداوم تا حدود 1 میلی لیتر تغلیظ کنید. که غلظت نهایی بستگی به غلظت پروتئین مورد نیاز دارد که معمولاً بیش از 500 میکرولیتر یا کمتر از 200 لیتر نیست. با توجه به غلظت حجمی حداقل 10 بار در هر بار، بیش از 1000 برابر سه برابر است که اساساً می تواند به هدف تغییر بافر دست یابد.

6. کنسانتره پروتئین نهایی را بردارید. روی یخ کار کنید با استفاده از نوک پیپت زرد (200ul)، نوک پیپت را به آرامی در امتداد لبه قرار دهید، سپس به آرامی محلول پروتئین را باد کرده و مخلوط کنید. مراقب باشید که غشای اولترافیلتراسیون را لمس نکنید. محلول غلیظ را هر بار تا 200 لیتر مکیده تا کاملا مکیده شود. نیازی به استخراج آخرین محلول غلیظ در ته لوله آزمایش نیست، در غیر این صورت کار بسیار دشواری است و ممکن است غشای اولترافیلتراسیون آسیب ببیند. در نهایت آب میلیک بدون عبور از غشای اولترافیلتراسیون به لوله اولترافیلتراسیون اضافه می شود تا از هدر رفتن آب و خشک شدن غشا جلوگیری شود.

7. مراحل زیر برای درمان لوله اولترافیلتراسیون و استفاده مجدد از لوله اولترافیلتراسیون آورده شده است.

8. داخل لوله اولترافیلتراسیون آب بریزید و چند بار به آرامی با آب میلیک بشویید. [اگر رسوب واضح پروتئین در انتهای لوله آزمایش وجود دارد، می توانید ابتدا آب اضافه کنید و سپس آن را با پیپت دور کنید. مراقب باشید که غشا را لمس نکنید. رسوب آویزان شده و سپس فرار می کند. شما نمی توانید آن را با آب لوله کشی کنید. پس از اضافه کردن 0.2m محلول NaOH، آن را به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید و در این مدت لوله اولترافیلتراسیون را متعادل کنید. 10 دقیقه دیگر سانتریفیوژ کنید. محلول NaOH باقیمانده را ریخته و هسته پنبه را در یک لیوان (1 یا 2 لیتر) آب میلیق غوطه ور کنید، برای چند ساعت قرار داده و سپس با آب جدید جایگزین کنید و چند ساعت برای رقیق شدن مداوم غلظت NaOH قرار دهید. لوله آزمایش 50 میلی لیتری را بشویید و با آب لوله کشی بپوشانید و دیواره داخلی را با آب میلیک بشویید.

9. هسته لوله آزمایش غوطه ور شده را خارج کرده، آن را به آب میلی لیتر کامل اضافه کنید و سپس لوله آزمایش 50 میلی لیتری را با آب میلیک پر کنید. به آرامی هسته لوله را در 50 میلی لیتر قرار دهید.

لوله را سانتریفیوژ کرده، تخلیه کرده و آب را تقسیم کنید، سپس آن را بپوشانید و تا استفاده بعدی در دمای 4 درجه نگهداری کنید. به طور کلی، با توجه به مراحل و اقدامات احتیاطی بالا، هر لوله در عرض سه یا چهار سال شکسته نخواهد شد.