واکسن صنعتی-فرایند تصفیه پاییندستی برای گاوی (IBR) - بخش «اولترافیلتراسیون»
رینوتراکئیت عفونی گاوی (IBR) در اثر عفونت با ویروس رینوتراکئیت عفونی گاوی (IBRV) ایجاد می شود که به عنوان ویروس هرپس نوع 1 گاوی (BHV-1) نیز شناخته می شود. این بیماری عمدتاً با علائم تنفسی و سقط جنین مشخص می شود. علاوه بر این تظاهرات بالینی، IBR می تواند منجر به کاهش تولید شیر در گاوهای شیری و کاهش افزایش وزن در گاوهای گوشتی شود و در نتیجه ضررهای اقتصادی قابل توجهی برای دامداری ها به همراه داشته باشد.
این بیماری ماهیت سرکوبگر سیستم ایمنی دارد. هنگامی که به عنوان یک عفونت رخ می دهد، بیماری زایی آن نسبتا کم است. با این حال، هنگامی که عفونت های مخلوط با سایر بیماری های ویروسی یا باکتریایی رخ می دهد، شدت و آسیب به طور قابل توجهی افزایش می یابد. واکسیناسیون مؤثرترین روش برای پیشگیری و کنترل است که دو نوع اصلی واکسن موجود است: واکسنهای ضعیف شده زنده و واکسنهای غیرفعال. در حال حاضر، واکسنهای عفونی رینوتراکئیت گاوی که در مزارع استفاده میشوند، عمدتاً واکسنهای غیرفعال هستند.
واکسن های زنده ضعیف شده با ایمنی زایی قوی، شروع سریع ایمنی و مدت زمان طولانی محافظت (معمولا بیش از شش ماه) مشخص می شوند. آنها معمولاً برای ایمن سازی اضطراری در هنگام شیوع بیماری استفاده می شوند. با این حال، آنها خطرات بالقوه ریزش ویروس را به همراه دارند، خطراتی برای گاوهای باردار ایجاد می کنند و نمی توانند در گاوهای آلوده اما بدون علامت استفاده شوند.
واکسنهای غیرفعال با ایمنی بالا، بدون خطر ریزش ویروس یا بازگشت به حدت مشخص میشوند و کاملاً ایمن در نظر گرفته میشوند. آنها را می توان در گاو در تمام مراحل از جمله گاو آبستن، گوساله و گاو نر استفاده کرد. با این حال، شروع ایمنی نسبتاً آهسته است و مدت زمان محافظت کوتاهتر است، بنابراین معمولاً به واکسیناسیونهای تقویتکننده نیاز است. در برخی موارد، اثر حفاظتی ممکن است ضعیف تر از واکسن های ضعیف شده زنده باشد.
صرف نظر از اینکه از یک واکسن زنده ضعیف شده یا یک واکسن غیرفعال استفاده می شود، فرآیند تصفیه پایین دستی را می توان به چهار مرحله اصلی تقسیم کرد: برداشت و شفاف سازی → غلظت و خالص سازی اولیه → خالص سازی پرداخت → غیرفعال سازی/فیلتراسیون استریل و فرمولاسیون.
تغلیظ یک مرحله اصلی در فرآیند تصفیه پایین دستی واکسن ها است که بلافاصله پس از شفاف سازی انجام می شود. هدف اصلی آن کاهش سریع محلول-حجم بزرگ، با غلظت کم{2}}ویروس شفاف شده به شکل کوچک-حجم-با غلظت بالا و در عین حال حفظ زیست فعالی ویروسی است. این شرایط لازم را برای مراحل بعدی-تصفیه خوب با وضوح بالا اما-ظرفیت پایین، مانند کروماتوگرافی، ایجاد میکند.
این مرحله معمولاً با استفاده از اولترافیلتراسیون جریان مماسی (TFF) انجام می شود. اصل به شرح زیر است: محلول خوراک ویروسی به موازات سطح یک غشای اولترافیلتراسیون با اندازه منافذ خاص جریان می یابد. تحت فشار، مولکول های کوچکی مانند آب، نمک ها و برخی ناخالصی ها به صورت عمود از غشاء عبور کرده و حذف می شوند، در حالی که ذرات دست نخورده ویروس که بسیار بزرگتر از منافذ غشاء هستند، حفظ می شوند، به طور مداوم در چرخش مجدد قرار می گیرند و متمرکز می شوند. در مقایسه با سانتریفیوژ با سرعت بالا{3}} سنتی، این روش برای ویروسهای شکننده مانند IBRV که دارای پوشش لیپیدی هستند ملایمتر است. این به طور موثر آسیب ساختاری ویروس و تلفات فعالیت ناشی از نیروهای برشی بالا را کاهش میدهد و برای تولید صنعتی در مقیاس خطی{5} بیشتر سازگار است.
یک عملیات تغلیظ موفق بسیار بیشتر از کاهش حجم است. نکات کلیدی برای بهینه سازی فرآیند عبارتند از: کنترل دقیق فشار گذر غشایی و سرعت جریان خوراک برای متعادل کردن راندمان فیلتراسیون در حالی که قطبش غلظت و رسوب غشاء را به حداقل می رساند. انتخاب مواد غشایی و اندازه منافذ مناسب برای اطمینان از حفظ بالای ویروس و شار نفوذ. و یافتن تعادل بهینه بین بازیابی ویروس، فاکتور غلظت و زمان پردازش. سوسپانسیون ویروسی غلیظ نه تنها به تیتر بسیار بالاتری دست می یابد، بلکه با حذف بخش زیادی از ناخالصی های محلول در آب، به تصفیه اولیه نیز می رسد. این حجم و پایه غلظت لازم را برای مراحل تصفیه حیاتی بعدی، مانند کروماتوگرافی و تیمار هستهای فراهم میکند و غلظت را به یک مرکز بازده مرکزی در کل فرآیند پایین دستی تبدیل میکند.
دیافیلتراسیون ثانویه یک مرحله مهم در تصفیه پایین دست واکسن است که پس از خالص سازی خوب و قبل از فرمولاسیون قرار می گیرد. معمولاً پس از کروماتوگرافی و تیمار نوکلئاز انجام می شود. هدف اصلی آن غلظت اولیه نیست، بلکه تبادل سیستم و تنظیم دقیق شرایط فرمول نهایی است. این فرآیند در یک سیستم اولترافیلتراسیون جریان مماسی (TFF) انجام میشود، که در آن بافر فرمولاسیون تازه و تمیز به طور مداوم به محلول ویروسی غلیظ در گردش اضافه میشود، در حالی که حلال اصلی و ناخالصیهای{3}}مولکول کوچک حذف میشوند. این عملیات به طور موثر و به آرامی نمک های باقیمانده، حلال های آلی، محصولات تجزیه نوکلئاز و ناخالصی های محلول باقی مانده از فرآیند تصفیه را حذف می کند.
نکته کلیدی حفظ حجم ثابت یا اعمال تنظیمات جزئی غلظت است تا اطمینان حاصل شود که غلظت ویروس مطابق با مشخصات فرمولاسیون است. برای ویروسهای شکننده و پوششدار مانند ویروس رینوتراکئیت عفونی گاوی (IBRV)، محیط هیدرودینامیکی ملایم دیافیلتراسیون ثانویه برای حفظ یکپارچگی ذرات و ایمنیزایی بسیار مهم است. در نهایت، این مرحله یک پایه محکم برای غیرفعال سازی بعدی (در صورت نیاز)، افزودن کمکی یا تثبیت کننده و پر کردن نهایی فراهم می کند و اطمینان می دهد که محصول نهایی با اجزای تعریف شده، شرایط یکنواخت و سازگاری خوب وارد فرمولاسیون می شود. بنابراین، این یکی از مراحل اصلی برای اطمینان از ایمنی، پایداری و سازگاری دسته ای واکسن است.
IBRV یک ویروس DNA خطی-دو رشته ای با پوشش تقریباً کروی است. ذرات بالغ IBRV قطری در حدود 160-230 نانومتر دارند. بر این اساس، استفاده از غشاهای اولترافیلتراسیون 100، 300 یا 500 کیلو دالتون میتواند همزمان با حذف برخی از پروتئینهای آلوده، IBRV را حفظ کند. نرخ بازیابی اولترافیلتراسیون کاست های غشایی فناوری Jiuling با نوع مواد خوراک متفاوت است، اما به طور کلی به 90-95٪ می رسد.