تجزیه و تحلیل کامل فرآیند تولید داروی MRNA: چگونه فناوری TFF چالش های تصفیه را حل می کند

در سال‌های اخیر، فناوری mRNA به پیشرفت چشمگیری در زمینه بیوداروسازی دست یافته است و پتانسیل کاربرد فوق‌العاده‌ای را به‌ویژه در واکسن‌ها و ژن‌درمانی نشان می‌دهد. توسعه موفقیت‌آمیز واکسن‌های mRNA نه تنها راه‌حل‌های جدیدی را برای پیشگیری و کنترل بیماری‌های عفونی ارائه کرده است، بلکه باعث پیشرفت در ایمونوتراپی سرطان و پزشکی شخصی شده است. به عنوان یک کلاس جدید از محصولات درمانی،-تولید mRNA در مقیاس بزرگ بسیار چالش برانگیز است، که شامل کنترل پایداری RNA، حذف آنزیم‌های باقیمانده و واکنش توسط محصولات، تبادل بافر، و دستیابی به -نرخ بازیابی خلوص بالا است که همگی نیازمند راه‌حل‌های تأییدشده{5} تولیدی هستند.

فرآیند ساخت واکسن‌های mRNA یا روش‌های درمانی عمدتاً به سه مرحله تقسیم می‌شود: تهیه محلول پلاسمید DNA، تهیه محلول حجیم mRNA و تهیه محصول دارویی mRNA-LNP.

نمودار جریان فرآیند تولید دارو mRNA

 

فیلتراسیون جریان مماسی (TFF)، به عنوان یک فناوری جداسازی غشایی به خوبی تثبیت شده، به دلیل قابلیت الک مولکولی با کارایی بالا، تبادل بافر قابل کنترل و ویژگی‌های تنش برشی کم، به طور گسترده در تولید mRNA استفاده می‌شود. بر اساس طراحی ماژول غشایی، پیکربندی‌های متداول TFF شامل{3}}کاست‌های صفحه تخت و ماژول‌های فیبر توخالی- است. علاوه بر این، جداسازی غشایی تحت فشار در TFF را می توان به میکروفیلتراسیون (MF)، اولترافیلتراسیون (UF)، نانوفیلتراسیون (NF) و اسمز معکوس (RO) با توجه به اندازه منافذ غشاء، با افزایش گزینش پذیری طبقه بندی کرد.

 

TFF در مراحل مختلف تولید داروی mRNA، از جمله تهیه توده DNA پلاسمید، تولید حجیم mRNA، و فرمول نهایی محصولات دارویی mRNA-LNP نقش حیاتی ایفا می کند. از طریق انتخاب مناسب نوع غشاء، قطع وزن مولکولی (MWCO) و مواد غشایی، TFF حذف موثر واکنش توسط محصولات و ناخالصی‌های کم وزن{3}مولکولی{4} را ممکن می‌سازد، در حالی که تبادل بافر و غلظت را قبل و بعد از کپسوله‌سازی LNP تسهیل می‌کند. این به طور قابل توجهی خلوص RNA، پایداری و مقیاس پذیری کلی فرآیند را افزایش می دهد.

 

علاوه بر این، عملکرد فیلتراسیون جریان مماسی تحت تأثیر عوامل پیکربندی سیستم مانند نوع پمپ و طراحی لوله و همچنین پارامترهای کلیدی فرآیند از جمله فشار غشایی (TMP)، تنش برشی و شار فیلتراسیون است. این عوامل باید با دقت انتخاب و بر اساس ویژگی‌های محصول هدف، به‌ویژه برای محصولات حساس به استرس مانند mRNA-LNP، که به شدت در برابر نیروهای مکانیکی خارجی در طول پردازش حساس هستند، انتخاب و بهینه شوند.

 

خالص سازی DNA پلاسمید

تهیه محلول ذخیره DNA پلاسمید اساساً بر اساس طراحی توالی الگوی رونویسی است. روش‌های آماده‌سازی معمولاً شامل تکثیر DNA پلاسمید است، اگرچه می‌توان از تقویت PCR نیز استفاده کرد. با در نظر گرفتن تقویت DNA به عنوان مثال، مهندسی شدهE. coliمعمولاً برای تقویت مبتنی بر تخمیر- استفاده می شود. فرآیند تصفیه پایین دست عمدتاً شامل جمع‌آوری سلول، لیز و شفاف‌سازی، غلظت و تبادل بافر، فیلتراسیون استریل، خطی‌سازی و خالص‌سازی کروماتوگرافی است. در تنظیمات صنعتی، سانتریفیوژ جریان پیوسته اغلب برای جمع آوری سلول استفاده می شود، اما نیروهای برشی نسبتاً بالایی ایجاد می کند. سیستم های فیبر توخالی، با کانال های باز و برش کم، برای جابجایی نمونه هایی با محتوای جامد بالا، ویسکوزیته بالا، یا حساسیت برشی مانند DNA پلاسمید مناسب تر هستند. پس از جمع‌آوری، سلول‌ها تحت همگن‌سازی با فشار بالا، فراصوت یا لیز قلیایی قرار می‌گیرند و به دنبال آن شفاف‌سازی اولیه از طریق فیلتراسیون عمقی انجام می‌شود.

 

برای تسهیل کروماتوگرافی بعدی، فیلتراسیون جریان مماسی (TFF) با استفاده از کاست های غشایی یا ستون های فیبر توخالی با وزن مولکولی 30 کیلو دالتون، 100 کیلو دالتون یا 300 کیلو دالتون اغلب برای غلظت و تبادل بافر استفاده می شود. این امر حجم نمونه را کاهش می دهد و همزمان برخی ناخالصی ها مانند RNA، پروتئین های سلول میزبان (HCP) و قطعات DNA سلول میزبان (HCD) را از بین می برد. کروماتوگرافی به عنوان مرحله خالص سازی هسته عمل می کند. به طور معمول، کروماتوگرافی تبادل آنیونی (AEX) با کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز (HIC) ترکیب می‌شود تا به طور موثر ناخالصی‌ها را حذف کند و DNA پلاسمید فوق‌پیچ‌دار بسیار زیست فعال را غنی کند، در نتیجه خلوص پلاسمید را به طور قابل‌توجهی بهبود می‌بخشد.

 

پس از خالص‌سازی، پلاسمید مجدداً در معرض TFF قرار می‌گیرد تا محلول به غلظت مورد نظر (معمولاً 0.5-2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) تغلیظ شود و با بافر ذخیره‌سازی نهایی دیالیز انجام شود. این مرحله نمک‌های باقی‌مانده و حلال‌های آلی را از فرآیند حذف می‌کند و تضمین می‌کند که سیستم بافر الزامات واکنش‌های رونویسی in vitro (IVT) را برآورده می‌کند.

 

خالص سازی mRNA ژن رونویسی شده در شرایط آزمایشگاهی (IVT).

رونویسی در شرایط آزمایشگاهی (IVT) و اصلاح فرآیندهای کلیدی برای تهیه محلول های ذخیره mRNA هستند. در طول تولید mRNA IVT، ترکیبی از فیلتراسیون جریان مماسی (TFF1) - کروماتوگرافی - فیلتراسیون جریان مماسی (TFF2) استفاده می شود. این استراتژی خالص‌سازی کارآمد و با کیفیت{4}mRNA را تضمین می‌کند و پشتیبانی حیاتی برای تولید واکسن ارائه می‌کند.

پس از تکمیل واکنش‌های رونویسی و اصلاح، اولترافیلتراسیون/دیافیلتراسیون با استفاده از کاست‌های غشایی یا ستون‌های فیبر توخالی با کاهش وزن مولکولی 30 کیلو دالتون، 100 کیلو دالتون یا 300 کیلو دالتون معمولاً ابتدا انجام می‌شود. این مرحله به طور موثر ناخالصی‌های مربوط به فرآیند{5} را از سیستم واکنش حذف می‌کند، مانند RNA پلیمراز، قطعات DNA باقی‌مانده، NTP‌های واکنش نداده، آنزیم‌های پوشاننده، -RNA دو رشته‌ای (dsRNA) و مهارکننده‌های{{7}مولکول کوچک، در حالی که به طور همزمان تبادل بافر حاصل می‌شود. پس از یک مرحله فیلتراسیون جریان مماسی، اکثر ناخالصی ها به طور موثر حذف می شوند و تنها ناخالصی پروتئین باقی مانده قابل تشخیص RNA پلیمراز است.

پس از آن، تکنیک های کروماتوگرافی متعدد برای خالص سازی بیشتر استفاده می شود. روش‌های رایج مورد استفاده عبارتند از کروماتوگرافی میل ترکیبی، اندازه-کروماتوگرافی حذف، یون-کروماتوگرافی معکوس زوج-و کروماتوگرافی تبادل یونی{4}. از طریق این ترکیب اولترافیلتراسیون و کروماتوگرافی متوالی، mRNA به سطح بالایی از خلوص دست می یابد.

 

برای برآوردن نیازهای فرمولاسیون یا ذخیره سازی، محلول ذخیره mRNA مجدداً با استفاده از کاست های غشایی 30 کیلو دالتون، 100 کیلو دالتون یا 300 کیلو دالتون یا ستون های فیبر توخالی تغلیظ یا رقیق می شود تا دقیقاً غلظت هدف تنظیم شود و به بافر فرمول نهایی مبادله شود. در نهایت، فیلتراسیون درجه استریل-برای کنترل بار میکروبی اعمال می‌شود و ذخیره‌سازی موقت و پر کردن مواد را تکمیل می‌کند.

Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).

 

خالص سازی mRNA{0}}فرمولاسیون LNP

نانوذرات لیپیدی (LNPs) در حال حاضر گسترده‌ترین سیستم تحویل درمانی برای mRNA هستند. در حال حاضر، فرمولاسیون‌های مختلف mRNA-LNP در مراحل مختلف توسعه بالینی و بالینی هستند. LNP ها به فرآیندهای تولید بسیار حساس هستند. در میان عملیات واحد مورد نیاز برای تولید mRNA{4}}LNP، غلظت و تبادل بافر از طریق فیلتراسیون جریان مماسی (TFF) و همچنین فیلتراسیون استریل چالش های مهمی را ایجاد می کند. این مراحل باید با دقت بهینه سازی شوند تا مقیاس پذیری فرآیند و کیفیت محصول تضمین شود و در عین حال از مسائلی مانند رسوب غشاء و بارگذاری نادرست فیلتر جلوگیری شود.

 

پس از محصور کردن mRNA، فیلتراسیون جریان مماسی (TFF) برای خالص سازی استفاده می شود. هدف از این مرحله حذف mRNA های بدون کپسول، پلیمرهای آزاد یا مواد لیپیدی و همچنین حلال های باقیمانده از mRNA و لیپیدها است. از آنجایی که mRNA{2}}LNP ها پایداری محدودی در دمای اتاق از خود نشان می دهند، بهینه سازی فرآیندهای پایین دستی، از جمله TFF، برای حفظ کیفیت محصول حیاتی است.

جهت‌های کلیدی بهینه‌سازی عبارتند از: تنظیم مناسب فشار گذر غشایی (TMP) و سرعت جریان مماسی بر اساس اندازه ذرات و پایداری mRNA-LNP برای متعادل کردن راندمان فیلتراسیون و تنش ذرات. انتخاب غشاها یا ستون‌های فیبر توخالی با وزن مولکولی مناسب (مثلاً 100 کیلو دالتون یا 300 کیلو دالتون) برای حذف مؤثر mRNA آزاد، ناخالصی‌ها و بافر تبادلی و در عین حال به حداقل رساندن جذب ذرات یا آسیب. و بهینه سازی غلظت و حجم دیافیلتراسیون برای اطمینان از تبادل موثر بافر در فرمول هدف و کنترل غلظت و پراکندگی ذرات نهایی.

 

علاوه بر این، ویژگی‌های کیفیت حیاتی (مانند اندازه ذرات، شاخص پراکندگی چندگانه [PDI]، و کارایی محصورسازی mRNA) باید در طول فرآیند به دقت پایش شوند و پارامترها به صورت پویا بر اساس داده‌های زمان واقعی تنظیم شوند تا به خالص‌سازی و فرمول‌بندی پایدار، مقیاس‌پذیر و کارآمد mRNANP{1} برسند.{1}

 

علاوه بر این، به دلیل ناپایداری mRNA{0}}LNPها و اجزای آنها تحت روش‌های استریل‌سازی نهایی، معمولاً از فیلتر استریل 0.2 میکرومتری{2}}برای حذف باکتری‌ها و سایر آلاینده‌های میکروبی استفاده می‌شود.