اشتراک ادبیات|خداحافظی از تصفیه پیچیده؟ یک روش جدید TFF + سورفاکتانت باعث افزایش کارایی و کاهش هزینه های تولید وکتور AAV می شود

ژن درمانی به سرعت در حال توسعه است ، اما هزینه بالای آن یک مانع بزرگ برای جلوگیری از دسترسی گسترده تر بیمار است. از جمله درایورهای اصلی این هزینه ، فرآیند تولید پیچیده بردارهای ویروس مرتبط با ویروس (AAV) Adeno {1} است. مطالعه ای که در بیوتکنولوژی و مهندسی زیستی منتشر شده است ، یک روش تصفیه جدید با ترکیب فیلتراسیون جریان مماس (TFF) با سورفاکتانت ها ایجاد کرده است ، که نوید می دهد فرآیند تصفیه AAV را ساده و کاهش دهد. بیایید در این تحقیق به رهبری تیمی از دانشگاه توکیو بپردازیم.

 

1. زمینه تحقیق: چالش ها و وضعیت فعلی تصفیه AAV

بردارهای AAV به دلیل ایمنی زیاد ، ایمنی کم ، توانایی آلوده کردن هم سلولهای تقسیم کننده تقسیم کننده و غیر {{0} و ظرفیت برای بیان ژن طولانی-} ، به ابزارهای تحویل "ستاره" در ژن درمانی تبدیل شده اند. با این حال ، فرآیند تولید آنها پیچیده است ، به ویژه مراحل تصفیه پایین دست ، که به طور معمول شامل چندین دور از سانتریفیوژ و کروماتوگرافی است. این روشها زمان- مصرف ، کار {5} 5}} فشرده ، مقیاس و پرهزینه است.

در مقیاس آزمایشگاهی ، تصفیه اغلب به کلرید سزیم یا چگالی چگالی چگالی چگالی ultracentrifugation متکی است ، که مقیاس برای تولید صنعتی چالش برانگیز است. کروماتوگرافی وابستگی به طور فزاینده ای مورد استفاده قرار می گیرد ، اما شرایط کم کاری pH که به آن نیاز دارد می تواند باعث عفونت ویروسی شود. بنابراین ، توسعه یک روش ساده ، کارآمد ، ملایم و مقیاس پذیر AAV بسیار مهم است.

فیلتراسیون جریان مماس (TFF) یک تکنیک جداسازی مبتنی بر اندازه {{0} است که معمولاً برای تمرکز و بافر-} تبادل بیوپودوکت ها استفاده می شود. با این حال ، TFF معمولی توانایی محدودی در از بین بردن ناخالصی هایی مانند پروتئین های سلول میزبان (HCP) و DNA در هنگام تصفیه AAV دارد ، و اغلب سنگدانه های پروتئین را پشت سر می گذارد.

 

2. رویکرد نوآورانه: TFF همراه با سورفاکتانت ها برای تصفیه کارآمد

برای غلبه بر محدودیت های TFF سنتی ، محققان Rimi Miyaoka ، Yuji Tsunekawa و همکاران در دانشگاه توکیو یک استراتژی هوشمندانه را ابداع کردند: استفاده از سورفاکتانت ها برای مهار تجمع و تعامل پروتئین های ناخالصی ، به آنها اجازه می دهد تا از طریق TFF Mafaltration Movlastration (500 KDA MELESARANTING) عبور کنند (500 KDA) در اندازه)

آنها سه نوع سورفاکتانت را آزمایش کردند:

• غیر - یونی:گلوکوزید اوکیتیل
• آنیونی:سدیم
• zwitterionic:قضیه

این مطالعه نشان داد که استفاده از یک سورفاکتانت یونی غیر-} به تنهایی بی اثر بود. هر دو سدیم سدیم دئوکسیچلات و zwitterionic هر دو به طور قابل توجهی حذف پروتئین های باقیمانده را افزایش می دهند و جمعیت پروتئین های مختلفی را هدف قرار می دهند. در نهایت ، ترکیب 0.5 ٪ deoxycholate سدیم با 1 ٪ CHAP نتایج قابل توجهی به دست آورد ، تقریباً به طور کامل پروتئین های میزبان باقیمانده را از بین می برد. تجزیه و تحلیل صفحه SDS - فقط سه باند پروتئین کپسید AAV شفاف (VP1/VP2/VP3) را نشان داد.

 

شکل 1 فرآیند تصفیه TFF بدون سورفاکتانت ها.(الف) SDS - صفحه الکتروفورز ژل ؛ (ب) میکروسکوپ الکترونی انتقال (TEM)

 

شکل 1 فرآیند تصفیه TFF با سورفاکتانت ها.(الف) SDS - صفحه الکتروفورز ژل ؛ (ب) میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)

 

3. نتایج تحقیق: خلوص بالا ، فعالیت و ایمنی

1. حذف ناخالصی کارآمد:روش جدید 99.98 ٪ حذف HCPS و حذف 95 ٪ DNA را به دست آورد ، با خلوص قابل مقایسه با یا بیش از آن کروماتوگرافی میل.
2. عفونت بهبود یافته:آزمایشات آزمایشگاهی نشان داد که بردارهای AAV1 با استفاده از این روش آلوده به سلولهای HEK293 آلوده به کارآمدتر از آنهایی که توسط کروماتوگرافی میل (24.9 ٪ در مقابل 20.8 ٪) خالص شده اند ، نشان می دهد که حفظ بهتر زیست ویروسی است.
3. ایمنی داخل بدن خوب:پس از تزریق موضعی بردارهای خالص AAV1 به عضله اسکلتی موش ، هیچ التهابی قابل توجهی یا آسیب بافتی پس از دو هفته مشاهده نشد ، که نشان دهنده ایمنی در داخل بدن است.
4. قابلیت استفاده از سروتیپ گسترده:این روش با موفقیت چندین سروتیپ - از جمله AAV1 ، AAV5 ، AAV8 و مایع رویی سلول AAV9-FROM را تصفیه کرد. با این حال ، برای AAV2 ، که به طور عمده در لیزهای سلول با بار ناخالصی بالا وجود دارد ، بهینه سازی بیشتری لازم است.

 

4. خلاصه و چشم انداز

این مطالعه یک فرایند ساده ، سریع (1.5 ساعت) ، کارآمد و مقیاس پذیر جدید AAV ایجاد کرد. با ترکیب سدیم deoxycholate و chaps ، با موفقیت به چالش تجمع پروتئین باقیمانده در هنگام تصفیه TFF پرداخت.

مزایای این روش شامل موارد زیر است:

• جلوگیری از شرایط سخت pH پایین ، حفظ فعالیت ویروسی بهتر
• کاهش مراحل کروماتوگرافی ، ساده کردن گردش کار و صرفه جویی در وقت و هزینه
• به راحتی مقیاس پذیر ، مناسب برای تولید مقیاس بزرگ -
• ارائه یک استراتژی جدید برای تصفیه سایر بیومکرومولکول ها مانند اگزوزوم ، ویروس های دیگر و آنتی بادی های نوترکیب

محدودیت های فعلی شامل بازیابی ویروسی زیر قطبی و عدم توانایی در جدا کردن کپسیدهای خالی از ذرات کامل ویروسی است ، نشان می دهد بهترین استفاده از آن ممکن است به عنوان اولین ضبط مرحله - در یک گردش کار تصفیه چند مرحله ای باشد.

در پایان ، این تحقیق گزینه جدیدی را برای تولید وکتور AAV پایین دست ارائه می دهد و این پتانسیل را دارد که هزینه داروهای ژن درمانی را به میزان قابل توجهی کاهش دهد و کاربرد گسترده آنها را تسهیل کند.