فناوری غشاء و شفاف سازی واکسن (Ⅰ)

واکسن ها از منابع مختلفی از جمله عصاره بافت، سلول های باکتریایی، ذرات ویروسی، پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک تولید شده توسط سلول های نوترکیب پستانداران، سلول های مخمر و حشرات تهیه می شوند.

متداول ترین روش تولید واکسن مبتنی بر فرآیند تخمیر اولیه و پس از آن خالص سازی است. تولید واکسن فرآیند پیچیده ای است که مراحل و فرآیندهای مختلفی را شامل می شود. انتخاب روش تصفیه مناسب برای دستیابی به خلوص محصول نهایی مورد نظر حیاتی است. شفاف سازی واکسن ها گام مهمی است که تأثیر قابل توجهی در بازیابی محصول و متعاقب آن تصفیه پایین دستی دارد. برای شفاف سازی واکسن ها می توان از چندین تکنیک استفاده کرد. انتخاب روش جمع آوری و تجهیزات به نوع باتری، ماهیت محصول جمع آوری شده و مایع فرآیند بستگی دارد. این تکنیک ها شامل فیلتراسیون غشایی (میکروفیلتراسیون، فیلتراسیون جریان مماسی)، سانتریفیوژ و فیلتراسیون عمیق (فیلتراسیون جریان عادی) است. از یک تجربه طولانی، شفاف سازی برداشت واکسن معمولاً با سانتریفیوژ و به دنبال آن فیلتراسیون عمیق به دست می آید.

 

در سال‌های اخیر، تکنیک‌های مبتنی بر غشاء در شفاف‌سازی واکسن برجسته شده‌اند. فرآیندهای بالادستی به طور فزاینده ای از فناوری های یکبار مصرف استفاده می کنند، بنابراین استراتژی های برداشت باید تغییر کند. این مقاله مروری جامع بر فناوری‌های مختلف مبتنی بر غشاء و کاربردهای آن‌ها در شفاف‌سازی واکسن ارائه می‌کند.

 

01 مقدمه

واکسن ها یک جزء حیاتی در پیشگیری از بیماری های عفونی هستند که همچنان عامل تکان دهنده مرگ هستند. سالانه بین 2 تا 3 میلیون نفر به لطف واکسیناسیون از بیماری دیفتری، کزاز، سیاه سرفه و سرخک نجات می یابند. واکسن‌ها طیف وسیعی را شامل می‌شوند، از پروتئین‌های نوترکیب کوچک گرفته تا کل ذرات ویروس و کل باکتری‌ها. آنها می توانند توسط سیستم های مختلفی تولید شوند: تخم، سلول های پستانداران، باکتری ها، و غیره. به دلیل پیچیدگی و تنوع واکسن ها، در حال حاضر هیچ پروتکل یا الگوی اصلی تصفیه وجود ندارد، علی رغم علاقه رو به رشد به پلت فرم های واکسن.

 

به طور معمول، فرآیند واکسن را می توان به سه بخش تقسیم کرد: بالادست (تولید و شفاف سازی)، تصفیه پایین دست (تصفیه شامل اولترافیلتراسیون، کروماتوگرافی و تصفیه شیمیایی) و فرمولاسیون (عملیات پر کردن نهایی). مستقل از سیستم تولید، شفاف سازی (حذف اولیه مواد ناخواسته) نقش کلیدی در تعیین یک فرآیند تصفیه قوی دارد. یک مرحله شفاف سازی مناسب عمدتاً سلول های کامل، بقایای سلولی، کلوئیدها و دانه های بزرگ را حذف می کند تا بار پردازش پایین دست را کاهش دهد. در برخی موارد، شفاف سازی همچنین می تواند ناخالصی های نامحلول، پروتئین های سلول میزبان (HCP) و اسیدهای نوکلئیک سلول میزبان را کاهش دهد. مانند هر مرحله دیگر تصفیه، مرحله شفاف سازی باید برای دستیابی به حداکثر بازده محصول و خلوص و در عین حال سازگاری با ویژگی و محدودیت های تولید واکسن بهینه شود.

 

با توجه به ناهمگونی انواع واکسن، تکنیک های مختلفی برای شفاف سازی استفاده می شود، از جمله سانتریفیوژ یا فیلتراسیون (جدول 1).

 

برای دستیابی به شفاف سازی مورد نظر معمولاً چندین سری عملیات لازم است. عملیات اول برای حذف ذرات بزرگتر (شفاف سازی اولیه) و عملیات دوم برای حذف کلوئیدها و سایر ذرات زیر میکرون (شفاف سازی ثانویه) طراحی شده است. سانتریفیوژ با سرعت کم به عنوان یک گزینه شفاف سازی یکباره عمل می کند و به سلول ها و بقایای سلولی اجازه می دهد تا با بارش از بین بروند. سانتریفیوژ می تواند بارهای جامد بالا را تحمل کند و به طور گسترده در سانتریفیوژهای دسته ای یا پیوسته و دیسکی استفاده شده است. این نیاز به سرمایه گذاری و هزینه های تعمیر و نگهداری بالایی دارد و به دلیل فقدان یک مدل کاهش قابل اعتماد با چالش هایی در افزایش مقیاس مواجه است. با این حال، برخی از تولیدکنندگان تجاری واکسن از سانتریفیوژها در تولید در مقیاس بزرگ که شامل حجم پردازش بالا و فعالیت های تولیدی بیشتر است، استفاده می کنند.

 

فیلتراسیون شفاف را می توان با فیلتراسیون جریان معمولی (NFF، همچنین به عنوان فیلتراسیون بن بست شناخته می شود) یا فیلتراسیون جریان مماسی (TFF، همچنین به عنوان فیلتراسیون جریان متقاطع شناخته می شود) انجام داد. همچنین حالت‌های فیلتر خاصی (فیلترهای عمیق) وجود دارد که حاوی مواد با بار مثبت و AIDS فیلتر هستند که حفظ بقایای سلولی، کلوئیدها و اجزای ناخواسته با بار منفی را افزایش می‌دهند.

 

فیلترهای غشایی ذرات را با حذف اندازه حفظ می کنند و ظرفیت نگهداری کثیفی بالایی ندارند، بنابراین برای مراحل شفاف سازی ثانویه مناسب هستند. هم فیلترهای عمیق و هم فیلترهای غشایی مقیاس و اجرا آسان هستند (طراحی سیستم ساده). برخلاف NFF، TFF عمدتا برای شفاف سازی اولیه (میکرو فیلتراسیون) استفاده می شود. غشاهای با محدوده برش 0.1-0.65 میکرومتر (ترجیحاً با کانال باز) با موفقیت برای حفظ سلول‌ها، بقایای سلولی و سایر آلاینده‌های بزرگ استفاده شده‌اند. اکثر تجهیزات TFF به صورت خطی مقیاس پذیر و قابل استفاده مجدد پس از تمیز کردن هستند، که به طور قابل توجهی هزینه مواد مصرفی برای مرحله را کاهش می دهد.

 

مرحله شفاف سازی بین فرآیندهای بالادست و پایین دست قرار دارد و گاهی اوقات در طول توسعه فرآیند واکسن نادیده گرفته می شود زیرا زمان و منابع برای سایر مراحل تصفیه، مانند کروماتوگرافی یا سانتریفیوژ گرادیان چگالی در اولویت قرار می گیرند.

 

حتی ثبت اختراع برای فرآیندهای تولید واکسن اغلب مرحله شفاف سازی را حذف می کند. کارایی شفاف سازی مستقیماً بر عملکرد فرآیند پایین دستی تأثیر می گذارد. یک مرحله شفاف سازی ضعیف می تواند بر ظرفیت فیلتر استریل شده تأثیر منفی بگذارد یا ممکن است عمر مفید رزین کروماتوگرافی را کوتاه کند. امروزه، انتظارات نظارتی سخت‌گیرانه‌تر باعث می‌شود که تولیدکنندگان واکسن، واکسن‌های خالص‌تر، با ویژگی‌های خوب اما مقرون به صرفه‌تر تولید کنند. در این مورد، هر مرحله باید به آن توجه شود که شایسته آن است. روندهای فعلی نشان می دهد که فرآیند بالادستی به سمت یک سیستم بیان "پاک تر" (یعنی سلول های کشت شده در محیط های بدون سرم جایگزین تخم ها) با افزایش بهره وری و تراکم سلولی بالاتر در حال حرکت است.

 

فرآیندهای تصفیه پایین دستی برای افزایش خلوص محصول نهایی ساده و ساده می شوند. برای رسیدگی به این تغییرات، مرحله شفاف سازی نمی تواند به یک گلوگاه تبدیل شود. در این مورد، فناوری فیلتراسیون با چالش شفاف سازی جدیدی روبرو می شود که به مسائل افزایش انعطاف پذیری فرآیند، امکان استفاده یکباره و کاهش هزینه های سرمایه گذاری می پردازد.

 

02 شفاف سازی واکسن های ویروسی

چندین نوع روش شفاف سازی، چه به تنهایی و چه در ترکیب، با موفقیت برای شفاف سازی برداشت در انتهای خوراک واکسن ها استفاده شده است.

مقیاس آزمایشی:1-20L، مقیاس تولید: بیش از 20 لیتر

 

2.1 اقدامات احتیاطی برای شفاف سازی واکسن ویروس

بسیاری از واکسن ها حاوی تمام یا بخشی از ذرات ویروس برای ایجاد ایمنی در برابر عفونت ویروسی هستند. آنها به طور کلی به چهار دسته کلی تقسیم می شوند:

واکسن زنده ضعیف شده (LAV)، که بر اساس یک سویه ضعیف از ویروس برای کاهش حدت آن است. ویروس های ضعیف شده می توانند در بدن تکثیر شوند اما بیماری زا نیستند.

- واکسن های ویروس غیرفعال (IV) که حاوی ویروس های غیرفعال شیمیایی یا فرابنفش برای از بین بردن عفونت هستند. ذرات ویروس را می توان کامل، تقسیم یا خالص کرد (فقط پروتئین های آنتی ژنی).

- واکسن ناقل ویروسی (VV) یک ویروس فعال و غیر بیماری زا است که آنتی ژن یک ویروس بیماری زا را ارائه می دهد. این ساختارهای اخیراً توسعه یافته برای کاربردهای ژن درمانی نیز استفاده می شوند.

واکسن‌های ذرات شبه ویروس (VLPs)، کلاس خاصی از واکسن‌های زیرواحد ویروسی که ساختار کلی ذرات ویروسی را تقلید می‌کنند اما حاوی مواد ژنتیکی عفونی نیستند.

 

در بیشتر موارد، ذرات ویروسی در مرحله شفاف سازی، حتی در هنگام لیز واکسن ویروسی، کاملاً دست نخورده می مانند (برش معمولاً در پایین دست، در یک محیط خالص تر انجام می شود).

چالش اصلی شفاف سازی ویروسی، بازیابی ذرات ویروسی با بازده بالا و در عین حال حذف موثر بقایای سلولی، توده های بزرگ و آلاینده های نامحلول است. همانطور که در بخش های بعدی توضیح داده شد، عوامل متعددی وجود دارند که می توانند باعث تخریب یا از بین رفتن ویروس شوند. علاوه بر این، به دلیل تنوع زیاد روش‌های سنجش کمی ویروسی در این مرحله از فرآیند، به ویژه برای واکسن‌های LAV و VV، تکیه بر بازده ویروس می‌تواند دشوار باشد. برای این واکسن‌ها، عملکرد ویروسی اغلب با استفاده از تست‌های عفونی مانند تست پلاک یا تست TCID 50 ارزیابی می‌شود. این واقعیت که برخی از ترکیبات برداشت شده ممکن است با توانایی ویروس در آلوده کردن سلول‌های نشان‌دهنده تداخل داشته باشند، تنوع این رویکرد کمی را افزایش می‌دهد.

 

2.2 استراتژی شفاف سازی واکسن ویروس

واکسن های ویروسی از نظر اندازه، ساختار، شکل و سیستم های بیان بسیار متفاوت هستند (جدول 3).

در نتیجه، به طور کلی هیچ قالبی برای فرآیندهای پایین دستی آن، به ویژه مراحل شفاف سازی وجود ندارد. در تئوری، تمام تکنیک های موجود (سانتریفیوژ با سرعت کم، میکروفیلتراسیون TFF، NFF) را می توان انتخاب کرد و به طور بالقوه برای شفاف سازی ویروس ترکیب کرد. در واقع، موفقیت روش های شفاف سازی تحت تأثیر سیستم بیان و ویژگی های فیزیکوشیمیایی ویروس های درگیر است.

 

Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>روش شفاف سازی {0}} سلول /ml) با استفاده از پلیمرهای کاتیونی، سطح فیلتراسیون عمیق را تا 4 برابر نسبت به روش های سنتی کاهش داد. این تکنیک امکان برداشت تخمیرکننده های با ظرفیت بالا را بدون استفاده از سانتریفیوژ فراهم می کند. به طور مشابه، Riske و همکاران. نشان داد که تیمار کیتوزان کشت سلولی 40 لیتری (0.02%) حاوی 1.{6}}.6 درصد مواد جامد منجر به افزایش {{8} برابری ظرفیت فیلتر مطلق پس از فیلتراسیون عمیق شد.

 

آنها همچنین اشاره می کنند که به نظر می رسد کیتوزان با لخته سازی ذرات زیر میکرونی، که معمولاً در سانتریفیوژها ته نشین می شوند، کارایی شفاف سازی را بهبود می بخشد. روش‌های پیش‌درمان و لخته‌سازی احتمالاً بخشی از شفاف‌سازی‌های آینده فیلتراسیون واکسن خواهد بود. مواد نافذ، از جمله قندها، گلیکول ها و اسیدهای آمینه، ترجیحاً ویروس ها را لخته می کنند. لخته سازی ویروسی با محلول اسمزی و به دنبال آن میکروفیلتراسیون 0.2μ می تواند به عنوان یک فرآیند جامع برای خالص سازی ویروس استفاده شود. مواد نافذ می توانند تجمع ویروسی را با کاهش لایه هیدراتاسیون در اطراف ذرات تحریک کنند تا ذرات ویروس آبگریز غیر کپسوله شده و ذرات ویروس محصور شده را لخته کنند. اگرچه نشان داده شده است که مواد نافذ ویروس‌ها را لخته‌سازی می‌کنند، این روش پتانسیل این را دارد که بستری برای خالص‌سازی واکسن در آینده باشد و امکان‌پذیری آن در تصفیه آزمایشی یا واکسن در مقیاس بزرگ ثابت نشده است. روش پیش تیمار لخته سازی، که احتمالاً بخشی از شفاف سازی فیلتر واکسن آینده خواهد بود، در یک تخمیر 2 لیتری انجام می شود. به منظور استفاده بالقوه در عملیات تولید در مقیاس بزرگ، این روش ها باید در مقیاس های آزمایشی و تولید تایید شوند.

 

2.2.1 بیان تأثیر سیستم

روش شفاف سازی عمدتاً به نوع فرآیند بالادستی و سیستم بیان بستگی دارد که نوع و سطح آلاینده های حذف شده را تعیین می کند. واکسن های ویروسی معمولاً در جنین مرغ توسط رده های سلولی مداوم پستانداران یا پرندگان یا سلول های باکولوویروس/حشره تولید می شوند که سیستم بیان پیچیده تری هستند. برخی از انواع VLP ها نیز ممکن است توسط سایر سیستم های بیان هترولوگ (باکتری ها، مخمرها، سلول های گیاهی) تولید شوند.

 

2.2.1.1 ویروس تولید شده در جنین مرغ

ده ها سال است که واکسن ها در تخم مرغ تولید می شوند. این کار به سال 1931 برمی گردد، زمانی که Woodruff و Good Pasture با موفقیت از غشای کوریوآلانتوئیک تخم های بارور به عنوان بستری برای رشد ویروس استفاده کردند. امروزه بسیاری از واکسن های انسانی و دامپزشکی با استفاده از این فرآیند قدیمی هنوز تولید می شوند. شناخته شده ترین احتمالاً واکسن آنفولانزای فصلی است. اصل این است که تخم مرغ را با ویروس های مورد نظر تلقیح کرده و سپس در غشای کوریوآلانتوئیک تکثیر کنید. پس از تولید مثل، مایع آلانتوئیک غنی از ذرات ویروسی جمع آوری و خالص می شود.

 

مایع آلانتوئیک یک خوراک شفاف کننده چالش برانگیز است. محتوای بالای مواد معدنی و پروتئین آن (از جمله اووالبومین) ویسکوزیته بالایی به آن می دهد. مایع آلانتوئیک همچنین حاوی ترکیبات بافتی ضروری از جنین مرغ، مانند پر، منقار، رگ های خونی یا سلول های خونی است. با توجه به محتوای جامد بالا، سانتریفیوژ با سرعت پایین گزینه ترجیحی برای شفاف سازی اولیه است که معمولاً منجر به نرخ بازیابی حدود 70٪ می شود. با این حال، شفاف سازی اولیه با استفاده از تکنیک های فیلتراسیون نیز امکان پذیر است. برای NFF، فیلترهای عمیق مبتنی بر پلی پروپیلن و سلولز قابلیت جمع آوری مایع آلانتوئیک خوبی دارند. فیلترهای سطحی ساخته شده از فیلترهای عمیق پلی پروپیلن یا سلولزی می توانند ظرفیت 150-210 L/m² داشته باشند و کدورت جریان خوراک را تا 3 برابر کاهش دهند. دستگاه TFF کانال تغذیه باز نیز برای شفاف سازی سیال آلانتوئیک مناسب است، زیرا دستگاه برای حداقل افت فشار از طریق کانال تغذیه مناسب تر است، بنابراین انسداد کانال را کاهش می دهد.

 

مرحله شفاف سازی ثانویه را می توان به راحتی با NFF انجام داد. ترکیبی از مواد پلی پروپیلن، سلولز و الیاف شیشه عموماً کارایی خوبی را نشان می‌دهد و جایگزینی برای مرحله شفاف‌سازی ثانویه، استفاده از TFF و دستگاه غشای میکروفیلتراسیون {{0}}.65μm یا 0.45μm و کارکرد شار اسمزی است. کنترل کنید. در این مرحله می توان از یک دستگاه TFF کانال باز با یک PVDF آبدوست یا یک غشای PES آبدوست استفاده کرد.

توجه به این نکته مهم است که ذرات ویروسی ممکن است با مواد باقیمانده نامحلول مرتبط باشند، که ممکن است به طور قابل توجهی تولید ویروس را در طول شفاف سازی کاهش دهد. استفاده از محلول نمک می تواند این ارتباط بین ویروس های آنفولانزا و قطعات جامد را کاهش دهد و در نتیجه تولید تقریباً دو برابر افزایش یابد بدون اینکه بر یکپارچگی ذرات ویروسی تأثیر بگذارد.

 

2.2.1.2 ویروس های تولید شده در رده های سلولی پی در پی پستانداران و پرندگان

اخیراً، برخی از واکسن‌های ویروسی از فرآیندهای مبتنی بر تخم‌مرغ به نفع فرآیندهای مبتنی بر کشت سلولی (مخصوصاً برای واکسن‌های آنفولانزا) فاصله گرفته‌اند. دلیل اصلی این تغییر، جلوگیری از مشکلات تولید واکسن مرتبط با تخم‌های جنینی است (یعنی کمبود تخم مرغ که ممکن است در صورت شیوع بیماری طیور رخ دهد). در نتیجه، بسیاری از انواع واکسن‌ها و ناقل‌های ویروسی در حال حاضر با استفاده از خطوط سلولی پیوسته پستانداران یا پرندگان، رده‌های سلولی معمولی (مانند رده‌های سلولی Vero، MDCK یا HEK293) یا خطوط سلولی اختصاصی ساخته شده‌اند.

 

بسته به سیستم بیانی، ویروس ممکن است در داخل سلول بماند و نیاز به مرحله لیز سلولی داشته باشد، یا ممکن است خارج از سلول بماند (لیز یا جوانه زدن). بار جامد و محتوای محلول حاصل از کشت سلولی بسیار تمیزتر از فاز مایع آلانتوئیک است. در نتیجه، پیاده سازی فناوری NFF آسان تر است و ظرفیت آن به طور قابل توجهی بالاتر است. با این حال، ظرفیت فیلتراسیون به شدت به شرایط کشت سلولی مانند تراکم سلولی یا زنده ماندن سلول در زمان برداشت بستگی دارد. این پارامترها بر میزان باقیمانده سلولی و ماکروآگرگات‌هایی که می‌توانند فیلترها و غشاهای عمیق را مسدود کنند، و در نتیجه ظرفیت کاهش می‌یابد، تأثیر می‌گذارند.

 

Thomassen و همکاران مثال خوبی از شفاف سازی NFF ارائه می دهند. در فرآیند تولید ویروس فلج اطفال غیرفعال (IPV) استفاده می شود. سلول‌های Vero کشت‌شده روی میکروحامل‌ها برای تکثیر ویروسی با تراکم سلولی .78 x 106 سلول در میلی‌لیتر TOI {{{0}}} استفاده شدند. یک صفحه استیل ضد زنگ 75 میکرومتری برای پیش شفاف سازی برای حذف ریزحامل ها از برداشت استفاده می شود. درجه بندی دو لایه با استفاده از یک فیلتر عمیق چگالی (0.{7}.0μm) و به دنبال آن یک فیلتر درجه استریل شده شفاف می شود.

واحد یکبار مصرف مقیاس پذیر انتخاب شده با موفقیت برای تهیه مواد کارآزمایی بالینی Sabin IPV در مقیاس 350 L استفاده شد. بسته به سروتیپ ویروس، نرخ بازیابی ویروس از 86 تا 96 درصد به دست می‌آید.

 

2.2.1.3 ذرات باکولوویروس/ویروس مانند تولید شده در سیستم سلولی حشرات

در نظر گرفتن سیستم های سلولی باکولوویروس/حشره برای تولید واکسن در مقیاس بزرگ نسبتاً جدید است، اما علاقه فزاینده ای را در زمینه ناقل های ویروسی و VLP ها جلب می کند. مزیت اصلی این سیستم این است که تولید کوتاه مدت (بدون نیاز به ایجاد خطوط سلولی) و ایمن (بدون DNA کامل ویروسی) است. همچنین برخی از معایب مانند نیاز به حذف باکولوویروس و پایداری محصول وجود دارد.

 

Cervarix، یک واکسن VLP علیه عفونت ویروس پاپیلومای انسانی تولید شده توسط GlaxoSmithKline، اولین واکسن انسانی است که به صورت تجاری در سلول های حشرات تولید می شود. تعدادی از واکسن‌های مبتنی بر VLPs و ناقل‌های rAAV تولید شده در سلول‌های حشرات آلوده به باکولوویروس در حال حاضر در دست توسعه هستند. رده‌های سلولی حشرات مشتق‌شده از کرم ارتشی پاییزی Spodoptera frugiperda (Sf9 و Sf21) و سلول‌های کرم خمیدگی کلم Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4) به دلیل توانایی آنها برای رشد در حالت تعلیق، که تکثیر بالادست را ساده می‌کند، بیشترین استفاده را دارند. فرآیند پس از رشد به تراکم مطلوب سلول های زنده، این سلول ها با باکولوویروس نوترکیب در فاز رشد نمایی سلولی برای بیان پروتئین آلوده می شوند. ژنوم بزرگ باکولوویروس ها امکان بیان پنج یا چند پروتئین مختلف را فراهم می کند که با پیچیدگی VLP و ناقل های ویروسی مطابقت دارد.

 

برنارد و همکاران فرآیند پایین دستی کشت سلولی حشرات را تشریح کرد. این فرآیند بسیار متغیر است و منعکس کننده تنوع پروتئین های تولید شده با این تکنیک است. اولین مرحله از توالی خالص سازی به شدت تحت تأثیر ویژگی های حجمی بیوراکتور (یعنی چگالی و زنده ماندن سلول) یا ماهیت انتشار محصول (ترشح شده توسط جوانه زدن یا لیز سلولی) است. عفونت باکولوویروس سلول‌های حشرات می‌تواند باعث لیز سلولی در عرض 3-5 روز شود. تخریب سلول ها ممکن است منجر به افزایش فعالیت پروتئولیتیک و سایر عوامل محیطی شود که می تواند منجر به تخریب پروتئین های نوترکیب شود.

تلاش‌هایی برای ایجاد باکولوویروس‌هایی با توانایی کمتر برای شروع لیز سلولی صورت گرفته است. باکولوویروس کمتر از 10 درصد حشرات آلوده را لیز می کند.

 

لیز سلولی را می توان با استفاده از روش های مختلفی مانند انجماد- ذوب، شوینده ها، هموژنایزرها یا درمان اولتراسوند انجام داد. سلول های حشرات دیواره سلولی ندارند و بنابراین به سرعت حل می شوند. اگرچه درمان اولتراسونیک در بسیاری از فرآیندهای نیمکتی گزارش شده است، اما به ندرت در مقیاس تجربی یا تجاری استفاده می شود. متداول ترین روش استفاده از هموژنایزر برای از بین بردن سلول ها در حضور مواد شوینده با غلظت پایین (0.1% Triton X-100 یا NP-40) است. استفاده از مواد شوینده و میکروسیال سازی یا همگن سازی ضربه اسمزی با موفقیت در بسیاری از فرآیندهای تولید در مقیاس بزرگ به کار گرفته شده است. به طور معمول، سلول‌های حشرات در بافرهای لیز معلق می‌شوند (50 میلی‌مولار TRIS pH7.7، 300 میلی‌مولار NaCl، 5 درصد گلیسرول، 0.2 میلی‌مولار PMSF، و مهارکننده‌های پروتئاز)، که طی آن Triton-X100 به غلظت نهایی 0.1٪ اضافه می شود و به دنبال آن اولتراسوند خفیف یا میکروسیال سازی انجام می شود. سپس این مخلوط برای حذف ذرات نامحلول سانتریفیوژ می شود.

 

در این مرحله، لیزات ممکن است بسیار کدر به نظر برسد و فیلتر کردن آن با استفاده از یک فیلتر 0.45μm دشوار است. گاهی اوقات تلفات تا 30٪ را می توان در مرحله شفاف سازی پیرولیز مشاهده کرد. افزودن بنزوآنزیم ها در مرحله برش به حل مشکل فیلتراسیون کمک می کند. تمیز کردن سلول ها با آب نمک بافر فسفات پس از برداشت و "یخ زدگی- ذوب" سریع در نمک بالا (500 میلی مولار NaCl) حاوی بافر ترک به حذف سنگدانه ها کمک می کند.

 

شفاف سازی VLP ها و ناقل های ویروسی تولید شده توسط سلول های حشرات پس از لیز سلولی (با عملیات شیمیایی یا مکانیکی) صورت می گیرد که نه تنها ذرات ویروسی بلکه مقادیر زیادی اسید نوکلئیک سلولی را نیز آزاد می کند. سلول های حشره می توانند با تراکم سلولی بالا رشد کنند، از 1-9.10 6 سلول در میلی لیتر. بنابراین، مرحله شفاف سازی باید با تراکم سلولی بالا، محتوای اسید نوکلئیک بالا و در صورت امکان حذف ذرات باکولوویروس باشد. برای پیچیده‌تر کردن اوضاع، VLPها یا ناقل‌های ویروسی و باکولوویروس‌ها می‌توانند اندازه‌های مشابهی داشته باشند (باکولوویروس‌ها 60-80 نانومتر عرض و 300-400 نانومتر طول دارند). با توجه به تراکم سلولی بالا، سانتریفیوژ تکنیک ارجح برای شفاف سازی اولیه برای دهه ها بوده است. با این حال، به نظر می رسد فرآیندهای غشایی جایگزین بسیار جذابی باشند زیرا مقیاس پذیری برای تعریف آسان است.

 

فیلترهای عمیق به طور موثر در فرآیند پایین دستی ذرات سه لایه روتاویروس مانند استفاده شده است. در سطح آزمایشگاهی، روش اولتراسانتریفیوژ با گرادیان چگالی CsCl اغلب برای خالص‌سازی این ذرات پیچیده استفاده می‌شود. محققان نه تنها مرحله شفاف‌سازی فیلتر عمیق، بلکه کل فرآیند پایین‌دستی (برش Triton X-100 و فیلتراسیون عمیق، به دنبال آن اولترافیلتراسیون و حذف اندازه ذرات) را نیز ارزیابی کردند. نتایج نشان می دهد که بازده گرادیان چگالی CsCl می تواند به 37 درصد برسد.

روش فوق گریز از مرکز حدود 10٪ است. به عنوان مثال دیگر، الیاف توخالی 0.45 میکرومتر و الیاف با قطر ریز 500 کیلو دالتون برای بازیابی و متمرکز کردن ذرات شبیه HIV تولید شده در سلول‌های حشرات استفاده شد. در این مطالعه، نیروی برشی الیاف توخالی بر اساس یکپارچگی سلول بهینه شد. ResultsA فرآیند نیروی برشی کم برای جایگزینی اولتراسانتریفیوژ با گرادیان قند جدول ایجاد شد.

 

این فرآیند پتانسیل قابل استفاده برای تولید انبوه را دارد. فیلترهای عمیق همچنین به طور موفقیت آمیزی در تولید ویروس های آدنو مرتبط با نوترکیب استفاده شده اند. لیز سلولی با یک پارازیت سلول مکانیکی دو پیستونی و به دنبال آن تیمار نوکلئاز انجام شد. در مرحله شفاف سازی، از عنصر فیلتر عمیق الیاف شیشه ای 1.2 میکرومتر استفاده شد و به دنبال آن از دو لایه PES آبدوست 0.8μm و PES آبدوست 0.2μm استفاده شد. فیلترهایی با اندازه متناسب برای دسته های فرآیندی از اندازه های کوچکتر تا 200 L استفاده می شوند. فیلترهای عمیق با موفقیت مورد استفاده قرار گرفته اند و رتبه بندی TFF با لایه های مسطح یا الیاف توخالی 0.2μm یا 0.45μm نیز بسیار موثر گزارش شده است.

 

مطالعه توسط Tecnologica (IBET) در موسسه زیست شناسی تجربی Oeiras در پرتغال از NFF برای شفاف سازی هپاتیت C VLP بیان شده توسط باکولوویروس ها بدون سانتریفیوژ استفاده کرد. فیلترهای پلی پروپیلن با رتبه اسمی (10،5،0.6 و 0.3μm) فیلترها برای شفاف سازی برداشت VLP استفاده می شوند. فیلترهای مشابه با رتبه منافذ 0.6μm و 0.3μm برای فیلتراسیون در مراکز برداشت VLP استفاده می شود. تمام فیلترهای مورد مطالعه برای نرخ بازیابی HCV-VLP مورد آزمایش قرار گرفتند و روش های فیلتراسیون توصیه شده با هم مقایسه شدند. نتایج در جدول 4 نشان داده شده است.

نتایج نشان داد که فیلتر 5μm-0.3μm بالاترین بازیابی محصول (100%) را برای خوراک VLP هپاتیت C مستقیم برداشت داشت. فیلتر پلی پروپیلن 0.6μm بالاترین بازیابی محصول (82٪) را برای خوراک مرکزی داشت و پاکسازی DNA سلول میزبان حدود 70٪ بود.

 

2.2.1.4 ذرات ویروس مانند تولید شده در سیستم های باکتریایی یا مخمری

نوع روش شفاف سازی برای واکسن های VLP که در سیستم های باکتریایی یا مخمری بیان می شود به آزادسازی VLP به واسطه های خارج سلولی بستگی دارد. اگر VLP ها نتوانند به طور موثر ترشح شوند، لیز سلولی یا سایر مراحل استخراج ممکن است قبل از مرحله شفاف سازی واقعی مورد نیاز باشد. در حالی که این استاندارد طلایی در صنعت شفاف سازی پروتئین است، سانتریفیوژ (پیوسته یا دسته ای) که در سیستم های باکتریایی یا مخمری بیان می شود، اخیراً، فرآیندهای غشایی به دلیل سهولت مقیاس پذیری و سازگاری با یک بار مصرف، جایگزین بسیار جذابی شده اند. درمان ها

 

Richter و Topell استفاده از سانتریفیوژ، TFF یا ترکیبی از هر دو را هنگام تهیه VLPهای تولید شده در E. coli شفاف شده توضیح می دهند. در کار آنها از غشاهای 45/0 متری TFF 0 برای رقیق کردن و شفاف سازی هموژنه های E. coli همگن در دمای 5 درجه استفاده شد. آنها همچنین خاطرنشان می کنند که TFF مبتنی بر غشاء برای مدیریت برداشت های با ویسکوزیته بالا، ترجیحاً با استفاده از واحدهای TFF با پیکربندی کانال باز، مناسب است.

شفاف سازی گریز از مرکز نیز به عنوان جایگزینی برای TFF ارزیابی شده است. در این مورد، هموژن حاصل رقیق نشد و در دمای 4 درجه به مدت 105 دقیقه، 10000 سانتریفیوژ شد. بدون انتقال پوشش نرم، مایع رویی از ذرات ریخته شد و مجدداً در دمای 4 درجه و 10000 گرم به مدت 60 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی از ذرات حاضر خارج شد، با بافر EB (43.89 میلی مولار Tris HCl، 6.11 میلی مولار Tris Base، 5.0 میلی مولار EDTA، 10% (v/v) Triton X{15}}) 1:2 رقیق شد و فیلتر شد. روی دستگاه فیلتر استریل 0.22 متری. پردازش بیشتر روند افزایش مقیاس برای تولید این واکسن VLP در E. coli در مقیاس 800L نیز بر اساس گزارش ها با ترکیب سانتریفیوژ و TFF روشن شد.

 

واکسن نوترکیب هپاتیت E HEV 239 در چین برای ایمن سازی بزرگسالان 16 سال و بالاتر مجوز گرفته است. آنتی ژن‌های واکسن (VLP) در E. coli بیان می‌شوند و افزایش مقیاس فرآیند تولید آنتی‌ژن در مقیاس 50 L نشان داده شده است. محصول با کراکینگ E. coli استخراج شد و اجسام انکلوزیون با شستشوی سنگین با بافر حاوی 2% تریتون X{5}} از قطعات سلولی جدا و سپس با هموژنایزر اوره 4 مولار حل شدند. TFF VLP ویروس پاپیلومای انسانی تولید شده در ساکارومایسس سرویزیه (15L) را شفاف می کند. لیزات سلولی تیمار شده با نوکلئاز با میکروفیلتراسیون جریان متقاطع در حالت ترانسفیلتراسیون با استفاده از فیلتر فیبر توخالی 0.65 میکرومتر روشن شد. از همین فرآیند در تولید واکسن استفاده می شود. اگرچه تنها تعداد انگشت شماری از واکسن‌های مبتنی بر VLP به مقیاس تجاری رسیده‌اند، چندین واکسن مبتنی بر VLP در حال توسعه هستند که بیشتر آنها با استفاده از سانتریفیوژ یا فناوری غشایی شفاف‌سازی می‌شوند.

 

با محدود شدن تأثیر فضا، نیمه دوم مطالب را در فصل بعدی به اشتراک خواهیم گذاشت. در مقاله بعدی مواردی از شفاف سازی واکسن و استفاده از اجزای غشایی مربوطه را به اشتراک خواهیم گذاشت.

 

Guidling Technology به عنوان اولین شرکت در مدار محلی سازی، تجربه کافی مرتبط در شفاف سازی واکسن را جمع آوری کرده است. Guidling Technology یک شرکت توسعه و تولید است که بر روی کشت بیودارویی و سلولی، خالص سازی و جداسازی تمرکز دارد. محصولات به طور گسترده ای در زیست پزشکی، تشخیص، فیلتراسیون مایعات صنعتی، تشخیص، شفاف سازی، تصفیه و فرآیند غلظت استفاده می شود. Guidling با موفقیت لوله سانتریفیوژ اولترافیلتراسیون، کاست غشایی اولترافیلتراسیون/میکروفیلتراسیون، فیلتر حذف ویروس، دستگاه فیلتر جریان مماسی، پشته غشای عمیق و غیره را توسعه داده است که به طور کامل با سناریوهای کاربردی بیودارویی و کشت سلولی مطابقت دارد.

 

غشاها و فیلترهای غشایی ما به طور گسترده در غلظت، استخراج و جداسازی پیش فیلتراسیون، میکروفیلتراسیون، اولترافیلتراسیون و نانوفیلتراسیون استفاده می شوند. طیف گسترده ای از خطوط تولید ما، از فیلتراسیون آزمایشگاهی یکبار مصرف کوچک گرفته تا سیستم های فیلتراسیون نوع تولید، آزمایش عقیم سازی، تخمیر، کشت سلولی و موارد دیگر، می تواند نیازهای آزمایش و تولید را برآورده کند.