مطالعه جایگزینی کروماتوگرافی ستونی سنتی با کروماتوگرافی غشایی برای خالص سازی آنتی بادی مونوکلونال

کروماتوگرافی بستر بسته بندی شده سنتی بالغ و قابل اعتماد است، اما با محدودیت هایی مانند راندمان انتشار کم، فشار برگشتی بالا و سرعت های پردازش آهسته محدود شده است، که همگام شدن با افزایش مداوم بهره وری فرآیندهای بالادستی را به طور فزاینده ای دشوار می کند. اخیراً یک مطالعه منتشر شده درپیشرفت بیوتکنولوژیپیشرفت بالقوه‌ای برای صنعت به ارمغان آورده است: کروماتوگرافی غشایی با مزایای بهره‌وری فوق‌العاده بالا و دوام قوی، می‌تواند جایگزین مؤثری برای کروماتوگرافی بستر بسته‌شده باشد و اساساً چشم‌انداز تصفیه mAb پایین‌دست را تغییر دهد.

پیشینه تحقیق

 

این مطالعه به طور سیستماتیک انواع مختلف دستگاه‌های کروماتوگرافی غشایی، از جمله غشاهای تبادل یونی و پروتئین A را ارزیابی کرد، و مقایسه‌ای جامع با کروماتوگرافی بستر بسته‌بندی شده سنتی در ابعاد مختلف، از جمله ظرفیت اتصال، پاکسازی ناخالصی، عمر مفید، و عملکرد کلی تصفیه انجام داد. سه پروتئین نوترکیب برای مطالعه انتخاب شدند-یک آنتی بادی مونوکلونال (mAb) و دو پروتئین فیوژن{4}Fc{5}}که فرآیند تصفیه کامل پایین‌دستی را از گرفتن تا پولیش پوشش می‌دهند. نتایج کلیدی آزمون به شرح زیر است:

 

1. مرحله ضبط: کروماتوگرافی غشایی پروتئین A - ظرفیت اتصال بالا در زمان‌های اقامت کوتاه

کروماتوگرافی پروتئین A یک مرحله حیاتی در جذب mAb است. این مطالعه عملکرد چهار غشای پروتئین A (سه محصول تجاری و یک غشای نمونه اولیه) را در برابر دو رزین بستر مرجع ارزیابی کرد:

• ظرفیت اتصال دینامیکی برجسته (DBC):دو غشا به مقادیر DBC بیش از 50 گرم در لیتر دست یافتند. برخی از غشاها ظرفیت اتصال 35-65 گرم در لیتر را حتی در زمان ماندگاری بسیار کوتاه 0.2 دقیقه، قابل مقایسه با رزین‌های بسته بندی شده سنتی (37-55 گرم در لیتر) حفظ کردند.
• افزایش چشمگیر بهره وری:زمان ماند کروماتوگرافی غشایی تنها 1/6-1/30 کروماتوگرافی ستونی سنتی بود (0.13-0.33 دقیقه در مقابل. 2-6 دقیقه)، که منجر بهافزایش 12 تا 35 برابری در بهره وری پردازش دسته ای.
• بهبودی پایدار:بازیابی پروتئین برای همه دستگاه های غشایی بیش از 85٪ است. غشای GORE بالاترین بازیابی 96٪ را به دست آورد که اساساً قابل مقایسه با رزین های سنتی بسته بندی شده (94-98٪) است.
• محدودیت هایی که باید در نظر گرفت:کروماتوگرافی غشایی حجم شستشو را تولید کرد1.4-5 برابر بیشتر استنسبت به رزین‌های بستر بسته‌بندی شده سنتی-، در حالی که کلیرانس HCP کمی پایین‌تر بود. برای برخی از غشاها، سطح HCP در مایع شوینده به 7000 پی پی ام رسید، در مقایسه با 4700 پی پی ام برای رزین های سنتی بسته بندی شده-. بنابراین،ممکن است برای جبران این محدودیت، مراحل پرداخت اضافی مورد نیاز باشد.

 

2. مرحله پرداخت: یون-مبادله / غشاهای چندوجهی - حذف کارآمد ناخالصی با پردازش سریع

هدف اصلی مرحله پولیش، حذف ناخالصی‌های باقیمانده مانند دانه‌های{0}}مولکولی- با وزن بالا (HMW) و پروتئین‌های سلول میزبان (HCP) است. این مطالعه سه نوع کروماتوگرافی غشایی را ارزیابی کرد: غشاهای تبادل آنیونی (AEX)، تبادل کاتیونی (CEX) و چندوجهی (MM).

• رکورد-شکستن بهره وری:زمان ماند برای کروماتوگرافی غشایی فقط بود0.17 دقیقه، در مقایسه با2-4 دقیقهبرای کروماتوگرافی ستونی سنتی، نشان دهنده aکاهش 12 تا 24 برابری در زمان اقامتو افزایش چشمگیر راندمان پردازش.
• پاکسازی ناخالصی قابل مقایسه با کروماتوگرافی ستونی سنتی:کروماتوگرافی غشایی به دست آمدفاکتورهای ترخیص HMW 4.2-5.5، نزدیک شدن به عملکرد رزین Capto Adhere (6). رافاکتور کلیرانس HCP به 60 رسید، با برخی از غشاها بهتر از کروماتوگرافی بستر بسته بندی شده سنتی-.
• بازیابی پروتئین رقابتی:اکثر غشاها به دست آمدبازیابی پروتئین بالای 90 درصدو برای برخی از پروتئین‌های همجوشی Fc-، بازیابی حتی بیشتر از آنچه با کروماتوگرافی ستونی سنتی به دست می‌آید بود.

 

3.-تأیید کامل فرآیند: کروماتوگرافی غشایی، تصفیه با خلوص بالا را فعال می‌کند

مطالعه یکفرآیند تصفیه یکپارچه مبتنی بر غشاء- ترکیبی از جذب پروتئین A با پرداخت، و مستقیماً آن را با فرآیند کروماتوگرافی بستر بسته بندی شده مرسوم مقایسه کرد:

• عملکرد با خلوص-بالا:به دنبال فرآیند تصفیه کامل بر اساس غشاء{0}، سطوح HCP در پروتئین‌های همجوشی Fc{1}}بهزیر 50 پی پی ام، با سنگدانه ها (گونه های HMW) درکمتر یا مساوی 0.5٪. برای آنتی بادی مونوکلونال، HCP به کاهش یافت226 ppm، با مصالح در1.0%، نزدیک شدن به عملکرد فرآیند کروماتوگرافی بستر بسته بندی شده مرسوم- (11 ppm HCP و 0.7٪ دانه ها).
• بهبود کلی بالاتر:به بازیابی کلی پروتئین فیوژن Fc- رسیده است89%، که بود19 درصد بالاترنسبت به فرآیند کروماتوگرافی بستر بسته بندی شده مرسوم-. برای آنتی بادی مونوکلونال، بازیابی بود73%قابل مقایسه با فرآیند معمولی-تخت بسته بندی شده.
• مقاومت در برابر رسوب قوی:کروماتوگرافی غشایی تحمل بهتری نسبت به مواد اولیه با بار ناخالصی بالا نشان داد و حتی زمانی کهغلظت اولیه HCP به 150000 ppm رسید.

 

4. عمر سرویس: عملیات پایدار برای چرخه‌های 100+ مطابق با الزامات تولید است

دوام غشاء عاملی حیاتی برای کاربردهای صنعتی است. این مطالعه پایداری غشاء را از طریق ارزیابی کرد201 چرخه عملیاتی متوالی:

• عمر چرخه طولانی:هفت غشا از هشت غشا تکمیل شدبیش از 100 سیکل، در حالی که نمونه اولیه غشاء چندوجهی (MM) رسیده است201 چرخهبدون کاهش قابل توجه عملکرد
• عملکرد پایدار:در طول مطالعه دوچرخه سواری،بازیابی پروتئین حدود 90٪ باقی مانده است، بدون کاهش قابل توجهی در عملکرد حذف HMW یا HCP. پروفیل های فشار نیز ثابت ماندند.
• مناسب برای کاربردهای تولیدی:اکثر غشاها قادر به پشتیبانی بودندحداقل یک چرخه کامل تولید، در حالی که برخی می توانند چندین دسته را پشتیبانی کنند. افزایش فشار انباشته را می توان با بهینه سازی کاهش داداستراتژی پاک-در-محل (CIP)..

 

نکات مهم فنی: چرا کروماتوگرافی غشایی می تواند جایگزین کروماتوگرافی ستونی سنتی شود؟

مزایای اصلی کروماتوگرافی غشایی از ساختار منحصر به فرد غشایی تخت-ش سرچشمه می گیرد. در مقایسه با رزین های کروماتوگرافی متخلخل معمولی، کروماتوگرافی غشایی سه تفاوت کلیدی را ارائه می دهد:

1. مکانیسم نوآورانه انتقال جرم:غشاها عمدتاً بر انتقال جرم همرفتی متکی هستند و نیاز به پخش شدن پروتئین ها در محیط متخلخل را از بین می برند. این به طور قابل توجهی زمان اقامت را کاهش می دهد و پردازش بسیار سریعتر را امکان پذیر می کند.
2. کاهش قابل توجه فشار برگشتی:ساختار ورق مسطح، مقاومت جریان پایینی را ارائه می‌کند و می‌تواند نرخ جریان بالاتری را در خود جای دهد، و بر محدودیت‌های فشار برگشتی که معمولاً با کروماتوگرافی ستونی سنتی مرتبط است، غلبه می‌کند.
3. سازگاری فرآیند قوی:کروماتوگرافی غشایی با ساخت مداوم سازگار است و بهتر می تواند با بهره وری بالای فرآیندهای بالادست مطابقت داشته باشد. علاوه بر این، ردپای تجهیزات کوچکتر و نیازهای کمتر به رسانه غشایی می تواند به کاهش هزینه های کلی تولید کمک کند.

البته کروماتوگرافی غشایی نیز محدودیت های خاصی دارد. اینها عبارتند ازحجم شستشوی بزرگتر، که نیاز به مصرف بافر اضافی دارند. نیاز به بهبود بیشتر در پاکسازی ناخالصی برای نمونه های چالش برانگیز مانندآنتی بادی های دو اختصاصی (bsAbs); و در دسترس بودن محدود برخی از محصولات غشایی در مقیاس های بزرگ تولیدی. با این حال، این چالش ها را می توان به تدریج از طریق طراحی تجهیزات بهینه، ادغام مراحل فیلتراسیون عمق{1} اضافی و سایر بهبودهای فرآیند برطرف کرد.

تأثیر صنعت: تولید آنتی‌بادی مونوکلونال وارد دوران تصفیه با راندمان بالا-

یافته های این مطالعه به صنعت بیوداروسازی جهت روشنی برای پیشرفت فناوری ارائه می کند. برای فرآیندهای متداول mAb و Fc{1}}تصفیه پروتئین فیوژن که بهره وری بالا را در اولویت قرار می دهند،کروماتوگرافی غشایی این پتانسیل را دارد که به طور کامل جایگزین کروماتوگرافی ستونی بسته بندی شده سنتی-. حتی برای مواد اولیه پیچیده تر، یک استراتژی ترکیبی با استفاده از کروماتوگرافی غشایی همراه با رزین های کروماتوگرافی معمولی می تواند به دستیابی به تعادل مطلوب بین راندمان پردازش و خلوص محصول کمک کند.

با ادامه پیشرفت فناوری‌های مواد غشایی، انتظار می‌رود که پیشرفت‌های آتی مصرف بافر را بیشتر کاهش دهد و مقیاس‌پذیری را بهبود بخشد و صنعت بیوداروسازی را به سمت تسریع بخشد.ساخت مستمر،-با راندمان بالا و مقرون به صرفه-.

برای تولیدکنندگان بیودارو،پذیرش اولیه و استقرار استراتژیک کروماتوگرافی غشایی می تواند به یک مزیت رقابتی مهم در بازار در حال توسعه تبدیل شود.