صنعتی-تصفیه پایین‌دستی باکتریوفاژها - بخش «تصفیه» و «اولترافیلتراسیون»

باکتریوفاژها که به نام فاژها نیز شناخته می شوند، ویروس هایی هستند که باکتری ها را آلوده می کنند. یک فاژ به تنهایی نمی تواند زنده بماند. باید یک باکتری میزبان را انگلی کند تا تولید مثل کند و در نهایت باعث لیز شدن باکتری شود. به دلیل خواص منحصر به فردشان، فاژها می توانند به صورت بالینی برای شناسایی و تایپ باکتری ها و همچنین برای درمان برخی عفونت های باکتریایی مقاوم استفاده شوند.

این یک نمودار شماتیک از ساختار باکتریوفاژ است (منبع تصویر: اینترنت).

 

تخمین زده می شود که بیماری های گیاهی سالانه بیش از 30 درصد از عملکرد جهانی محصول را از دست می دهند. در میان پاتوژن های مختلف، کنترل بیماری های باکتریایی به ویژه دشوار است. روش‌های کنترل سنتی عمدتاً به آنتی‌بیوتیک‌ها و عوامل{3}} مبتنی بر مس متکی هستند. با این حال، استفاده بیش از حد از آنتی بیوتیک ها منجر به مقاومت ضد میکروبی شدیدتر شده است، در حالی که استفاده طولانی مدت از ترکیبات مس منجر به تجمع محیطی می شود که خطرات سلامتی را برای انسان و حیوانات به همراه دارد.

 

از آنجایی که باکتریوفاژها ویژگی بالایی دارند، می توانند به طور انتخابی باکتری های بیماری زا را بدون آسیب رساندن به میکروب های مفید یا سایر سلول های میزبان از بین ببرند. بنابراین، فاژها می توانند به عنوان جایگزینی برای آنتی بیوتیک ها و عوامل مبتنی بر مس- عمل کنند. از طریق فاژ درمانی، پاتوژن ها را می توان به طور موثر حذف کرد و در عین حال مصرف آنتی بیوتیک ها و ترکیبات مس را کاهش داد.

 

با پیشرفت های مداوم علمی و تکنولوژیکی و تحقیقات عمیق تر در مورد باکتریوفاژها، چشم انداز استفاده از فاژها برای درمان ابر میکروب ها به طور فزاینده ای امیدوار کننده می شود. انتظار می رود در آینده، فاژ درمانی به یکی از راه حل های کلیدی برای مقاومت آنتی بیوتیکی تبدیل شود. از طریق تحقیقات و اکتشافات در حال انجام، فاژ درمانی ممکن است به عنوان یک نیروی اصلی در زمینه درمان ضد میکروبی ظاهر شود و کمک بیشتری به سلامت انسان کند.

 

با این حال، برای تزریق ایمن و مؤثر باکتریوفاژها به بدن انسان-به‌ویژه از طریق تزریق داخل وریدی (IV)-یک چالش عمده باقی می‌ماند:چگونه می توان آماده سازی فاژ فوق{0} خالص را بدست آورد.

لیزات فاژ مخلوط پیچیده ای است که علاوه بر فاژهای هدف، حاوی ناخالصی های عمده ای مانند: باکتری های میزبان و قطعات آنها، DNA ژنومی و پروتئین های میزبان (ناخالصی های مربوط به میزبان) است. اندوتوکسین‌ها مانند لیپوپلی‌ساکاریدها (LPS) (ناخالصی‌های مرتبط{1}}). و ناخالصی های مرتبط{2}}از جمله کپسیدهای خالی و دم شکسته.

بنابراین، هدف خالص‌سازی نه تنها دستیابی به تیتر فاژی بالا، بلکه کاهش ناخالصی‌ها-به‌ویژه اندوتوکسین‌ها، DNA میزبان و پروتئین‌ها- به سطوح بسیار پایینی است که توسط استانداردهای داروسازی مشخص شده است.

یک فرآیند خالص سازی فاژ قوی و مقیاس پذیر به طور کلی از اصول رایج پردازش پایین دست پیروی می کند و می تواند به مراحل منطقی زیر تقسیم شود:

فرآیند تصفیه پایین دست باکتریوفاژها

 

شفاف سازی - حذف ناخالصی های ماکروسکوپی

در مرحله اولیه خالص سازی باکتریوفاژ، هدف اولیه مرحله شفاف سازی حذف موثر سلول های باکتریایی دست نخورده و بقایای سلولی بزرگ از لیزات خام است. هدف اصلی این مرحله ارائه یک تغذیه تمیز برای ستون های کروماتوگرافی پایین دست یا واحدهای جداسازی غشایی است که بار ذرات جامد را به حداقل می رساند. این به طور موثر از گرفتگی در واحدهای تصفیه بعدی جلوگیری می کند و عملکرد پایدار و راندمان فرآیند بالا را در سراسر گردش کار تصفیه تضمین می کند.

در فرآیندهای سنتی باکتریوفاژ پایین‌دست، شفاف‌سازی معمولاً متکی به-سانتریفیوژ با سرعت کم همراه با-فیلتراسیون عمقی چند مرحله‌ای{2}}که معمولاً به‌طور متوالی از فیلترهای 0.8μm، 0.45μm و 0.22μm عبور می‌کند تا به‌طور مؤثر فیلترها را حذف کند{6}. اگرچه این رویکرد بالغ و قابل اعتماد است، اما این رویکرد شامل مراحل متعددی است، زمان‌بر است و به انتقال مواد مکرر نیاز دارد و فضایی را برای بهینه‌سازی در بازده و کارایی کلی باقی می‌گذارد.

 

جایگزینی{0}}فیلتراسیون عمقی چند مرحله ای با یککپسول میکروفیلتراسیونمی تواند فرآیند را به طور قابل توجهی ساده و تشدید کند. به طور خاص، پس از حذف اکثر بقایای سلولی از طریق سانتریفیوژ-کم، لیز می تواند مستقیماً توسطفیلتراسیون جریان مماسی (TFF)با استفاده از کپسول های میکروفیلتراسیون با اندازه منافذ مشخص (0.45μm یا 0.22μm). این امر حذف ریز ناخالصی های ذرات و نفوذ موثر فاژهای هدف را در aتک قدمی، به طور موثر سه مرحله فیلتراسیون سنتی را در یک مرحله یکپارچه می کند.

این نوآوری نه تنها زمان عملیات و جابجایی دستی را تا حد زیادی کاهش می دهد، بلکه از دست دادن نمونه و خطر آلودگی ناشی از چندین مرحله فیلتراسیون را نیز به حداقل می رساند و در نتیجه بازیابی کلی فاژ را بهبود می بخشد. در همین حال، عملیات جریان مماسی رسوب غشاء را کاهش می دهد، توان عملیاتی را افزایش می دهد و استحکام فرآیند را تقویت می کند.

 

بنابراین، اتخاذ یکاستراتژی شفاف سازی یکپارچه با ترکیب کپسول های-سانتریفیوژ و میکروفیلتراسیون کم سرعتنشان دهنده یک رویکرد موثر برای بهبود کارایی و هزینه-اثربخشی-تولید باکتریوفاژ در مقیاس بزرگ است. کپسول های میکروفیلتراسیون Guidling Technology معمولاً می توانند کدورت خوراک را به زیر کاهش دهند20 NTU، به طور کامل الزامات مراحل اولترافیلتراسیون و کروماتوگرافی بعدی را برآورده می کند.

 

جذب و تمرکز - تصفیه اولیه و کاهش حجم

در طولجذب و تمرکزمرحله خالص سازی باکتریوفاژ، هدف اصلی بازیابی موثر فاژها از حجم زیادی از لیزات شفاف شده و همزمان دستیابی به غلظت اولیه محصول و تبادل بافر است. این مرحله در درجه اول متکی استفیلتراسیون جریان مماسی (TFF)تکنولوژی

 

اصل TFF در استفاده از غشاهای اولترافیلتراسیون با کاهش وزن مولکولی خاص (معمولاً 100 یا 300 کیلو دالتون) نهفته است. ناخالصی های مولکولی کوچک مانند اجزای محیط کشت باقیمانده، متابولیت ها و پروتئین های کوچک به طور انتخابی از منافذ غشایی عبور می کنند، در حالی که فاژها در محفظه نگهداری می شوند.اثرات حذف اندازه، جداسازی و غنی سازی موثر آنها را ممکن می سازد.

در یک سیستم TFF،حالت اولترافیلتراسیونبرای دستیابی به غلظت حجم، در حین تغییر به استفاده می شودحالت دیافیلتراسیوناجازه تبادل بافر را می دهد، بنابراین شرایط فیزیکوشیمیایی مناسب برای مراحل بعدی مانند درمان آنزیمی ایجاد می کند.

این فناوری مزایای ترکیبی را ارائه می دهدراندمان پردازش بالاومقیاس پذیری عالی، آن را برای تولید-در مقیاس بزرگ ایده آل می کند. با توجه به GuidlingTechnology، کپسول های اولترافیلتراسیون به طور معمول به یکنرخ بازیابی فاژ 90-95٪بسته به ماده خاصی که در حال پردازش است.

 

تصفیه عمیق - حذف هدفمند ناخالصی های بحرانی

در تصفیه باکتریوفاژ،تصفیه عمیقمرحله کلیدی است که کیفیت محصول نهایی را تعیین می کند. هدف اولیه آن استحذف ویژه ناخالصی های بحرانیمانند اندوتوکسین ها. سنتیسانتریفیوژ گرادیان چگالی CsCl-به دلیل سمی بودن و عدم مقیاس پذیری آن-از فرآیندهای صنعتی حذف شده است. رویکردهای فعلی برفن آوری های مبتنی بر کروماتوگرافی{0}}، با ادغام نوآورانه ازپیش تیمار آنزیمی.

 

یک استراتژی پیشرفته ترکیبیکروماتوگرافی تبادل آنیونی (AEC)باپیش تیمار آلکالین فسفاتاز (AP)توسعه یافته است. هم فاژها و هم لیپوپلی ساکاریدها (LPS) حامل بارهای منفی هستند که منجر به رقابت برای مکان‌های اتصال در فرآیندهای AEC معمولی می‌شود و باعث شستشوی هم‌{1}}می‌شود که کارایی تصفیه را کاهش می‌دهد. با معرفی پیش تیمار AP قبل از بارگذاری AEC، آنزیم به طور خاص گروه های فسفات را از لیپید A و نواحی پلی ساکارید هسته مولکول های LPS حذف می کند و بار منفی خالص آنها را به میزان قابل توجهی کاهش می دهد. این به طور موثر میل آنها را برای محیط تبادل آنیون تضعیف می کند.

داده های تجربی نشان می دهد که درمان نمونه با20 U/mL APبه دنبال آن تصفیه با استفاده ازجاذب غشای لیگاند آمین چهارتایی (Q) یا ستون های یکپارچهمی تواند به دست آوردحذف 98.8 درصد اندوتوکسین، در حالی که نرخ بازیابی فاژ عالی را حفظ می کند. این رویکرد با موفقیت مشکل دیرینه-هم جذب اندوتوکسین{2}}در طول تصفیه فاژ را حل می کند.

پولیش - پالایش نهایی و فرمولاسیون

 

در فینالمرحله پولیشاز خالص سازی باکتریوفاژ، هدف اصلی دستیابی به خلوص نهایی و آمادگی فرمولاسیون است. این شامل حذف ناخالصی‌های باقیمانده، حذف افزودنی‌های وارد شده در طول فرآیند (مانند آلکالین فسفاتاز)، و تعویض کامل محصول به یک سیستم بافر سازگار با فرمول-می‌شود.

این معمولاً از طریق انجام می شوددیافیلتراسیون ثانویه، یک روش اثبات شده و کارآمد که هم حذف عمیق آلاینده های مولکولی کوچک و هم تبادل کامل بافر را امکان پذیر می کند.

 

برای افزایش بیشتر خلوص محصول،کروماتوگرافی برهمکنش پیوند هیدروژنی-یاکروماتوگرافی حالت مختلط (MMC)را می توان به عنوان الف معرفی کردمرحله نهایی پولیش. این تکنیک‌ها از مکانیسم‌های جداسازی چند بعدی برای حذف اجزای ردیابی با خواص فیزیکوشیمیایی مشابه با فاژ هدف استفاده می‌کنند. نتیجه یک ماده دارویی فعال باکتریوفاژ بسیار خالص شده (API) است که استانداردهای کیفی دقیق مورد نیاز برایفرمولاسیون{0}}درجه تزریقی.

با انتخاب ترکیبی از ماژول های غشای میکروفیلتراسیون و اولترافیلتراسیون با مساحت غشاء 1 متر مربع، حداکثر حجم تخمینی باکتریوفاژ قابل پردازش تا 100 لیتر می رسد. شار مواد میکروفیلتراسیون تقریباً 20-50 LMH است و شار مواد اولترافیلتراسیون تقریباً LMH30-15 است. در مقایسه با روش‌های پردازش سنتی، این رویکرد می‌تواند به طور موثری نیازهای فرآیند را برای شفاف‌سازی و اولترافیلتراسیون برآورده کند.

مراجع:

ساودرا و همکاران،خالص سازی مقیاس پذیر آماده سازی باکتریوفاژ (2025)

لاپراس و همکاران،منطقی کردن فرآیند تصفیه برای یک ماده دارویی فعال فاژ (2024)