مطالعه کاربرد فیلتراسیون عمیق در فرآیند تولید واکسن بیماری تب برفکی

مقدمه - بیماری پا و دهان چیست؟

در قرن چهاردهم، سوابق مکتوب از بیماری تب برفکی مشابه در اروپا وجود دارد. بیماری تب برفکی یک بیماری حاد، تب دار و بسیار مسری است که توسط ویروس تب برفکی ایجاد می شود.

علائم بالینی حیوانات بالغ عبارتند از: افزایش دمای بدن، ایجاد تاول و زخم در دهان، تاول و زخم در سم و حتی ریزش پوسته سم، ایجاد مشکل در خوردن و خوابیدن، کاهش وزن و حتی کاهش ارزش اقتصادی در حیوانات اقتصادی. ;

علائم بالینی حیوانات جوان عبارتند از: افزایش دمای بدن، میوکاردیت و سایر علائم، پس از شروع، حیوانات جوان مرگ و میر بالایی دارند.

 

چکیده

در طول 500 سال گذشته، بیماری تب برفکی بارها در سراسر جهان شیوع یافته است و تعداد زیادی از خوک، گاو، گوسفند و سایر حیوانات اهلی و صحرای پنجه وحشی مرده یا بیمار شده‌اند که به شدت دام‌ها را تحت تأثیر قرار داده است. و صنعت پرورش.

 

به منظور بررسی کاربرد فناوری فیلتراسیون عمیق در فرآیند تولید واکسن تب برفکی، عملکرد فیلترپذیری فیلتراسیون سطحی و فیلتراسیون عمیق و همچنین اثر محافظتی بر فیلتراسیون باکتریایی مورد آزمایش و مقایسه قرار گرفت. مزایای فیلتراسیون عمیق بار بالا در حذف بقایای سلولی مورد مطالعه قرار گرفت. طرح های فیلتراسیون مربوطه برای محیط کشت سلولی با کدورت های مختلف مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

 

نتایج نشان داد که بار فیلتراسیون عمیق 13.9 برابر فیلتراسیون سطحی، کدورت مایع فیلتر تنها 23.5 درصد از فیلتراسیون سطحی و پس از آن بار باکتری زدایی 0.2um 7.2 برابر بیشتر از میزان فیلتراسیون سطحی بود. فیلتراسیون سطحی با استفاده از لیگاند رزین مخصوص آن، کدورت مایع فیلتر 38.6 درصد از فیلتر عمیق معمولی با اندازه منافذ یکسان است که برای محافظت از فرآیند پایین دست مفید است. نتایج نشان داد که فیلتراسیون عمیق، به ویژه فیلتر عمیق بار مثبت قوی، می تواند به طور موثر در تولید واکسن FMD اعمال شود و فرآیندهای فیلتراسیون مناسب باید برای محیط های کشت مختلف ایجاد شود.

 

بیماری تب برفکی و فیلتراسیون عمیق

بیماری تب برفکی (FMD) یک بیماری حاد، تب دار و مسری در حیوانات سم پاشی است که توسط ویروس تب برفکی (FMDV) ایجاد می شود. حیواناتی که بیشتر در معرض ابتلا به این بیماری هستند شامل گاو، خوک و گوسفند است. بیماری تب برفکی در آسیا، آفریقا، خاورمیانه و آمریکای جنوبی بومی است و شیوع بسیار بالایی دارد و سریع انتقال می یابد. سازمان جهانی بهداشت حیوانات (OIE) آن را به عنوان اولین بیماری مشترک بین انسان و دام در دسته A فهرست می کند و کشورهای عضو را ملزم می کند بیماری تب برفکی را در فهرست بیماری های حیوانی قابل اطلاع قرار دهند. واکسیناسیون یک ابزار موثر برای پیشگیری خاص از FMD ​​است. واکسن غیر فعال FMD که از غیرفعال کردن ویروس دست نخورده با غیرفعال کننده ساخته می شود، نقش مهمی در پیشگیری و کنترل FMD دارد.

آنتی ژنی خود FMDV ضعیف است و غیرفعال شدن ویروس تأثیر زیادی بر آنتی ژن آن دارد. بنابراین، در تولید فعلی واکسن FMD، واکسن FMD با خلوص بالا می تواند از محتوای آنتی ژن و خلوص دوز واحد اطمینان حاصل کند، که این امر بسیار مهم است و همچنین استراتژی واکسیناسیون فعلی است. این امر الزامات بالایی را برای تصفیه پایین دست ویروس ها ایجاد می کند. علاوه بر این، قبل از سال 2009، بالادست واکسن‌های غیرفعال تب برفکی در چین عمدتاً از روش کشت چرخاندن بطری و چسبیدن به دیوار استفاده می‌کردند. با افزایش تقاضا برای واکسن، معایب این روش کشت که نیاز به تعداد زیادی بطری چرخان، راندمان پایین و سطح بیان پایین دارد به تدریج نمایان شد.

بنابراین، در سال های اخیر، فناوری کشت سلولی به آرامی از کشت چسبنده قبلی به کشت سوسپانسیون تغییر کرده و تولید ویروس به طور قابل توجهی بهبود یافته است. با این حال، با افزایش تولید ویروس، تغییر حالت کشت فشار بیشتری را به تصفیه پایین دست وارد کرده است، زیرا بقایای سلولی تولید شده توسط فرآیند کشت، آزادسازی سلولی پروتئین میزبان، DNA میزبان و غیره به ترتیب افزایش یافته است. الزامات بیشتری را در مورد توانایی تصفیه پایین دست قرار می دهد.

فناوری فیلتراسیون غشایی به طور گسترده در فرآیند تولید محصولات بیولوژیکی مانند واکسن ها استفاده می شود که در این میان از فناوری فیلتراسیون DC معمولاً در فرآیند برداشت زهر بیماری برای جداسازی ناخالصی های نامحلول مانند بقایای سلولی استفاده می شود. در شفاف سازی اولیه FMDV، فناوری فیلتراسیون سطحی که توسط عنصر فیلتر غشایی تاشو ارائه می شود، عمدتاً مورد استفاده قرار گرفت. با تغییر شرایط کشت، افزایش ناخالصی های بقایای سلولی، فیلتراسیون سطحی برای دستیابی به اثر شفاف سازی دشوار است و به دلیل کم بودن بار فیلتراسیون سطح، هزینه مواد فیلتر بیشتر و بیشتر می شود.

 

تحت زمینه فوق، فیلتراسیون عمیق بیش از پیش در فرآیند جداسازی سیتولیکیدی FMDV اعمال شده است. مواد فیلتر عمیق معمولاً از الیاف بلند و ریز از منابع طبیعی تشکیل شده است و کانالی که توسط محیط فیلتر پس از تشکیل یک فیلم تشکیل می‌شود، اغلب بسیار پرپیچ‌وخم است، شبیه به ساختار دیافراگم لابیرنت. ذرات ناخالصی اغلب در داخل فیلتر به جای روی سطح محبوس می شوند. علاوه بر این، دیواره کانال فیلتر اغلب بخشی از ناخالصی‌های ذرات بسیار ریز را با اثر الکترواستاتیک یا نیروی بین مولکولی جذب می‌کند. به طور کلی، مکانیسم فیلتراسیون فیلتراسیون عمیق با حفظ مکانیکی و جذب مشخص می شود.

 

روش فیلتراسیون جریان ثابت

صفحه فیلتر عمیق را روی دستگاه فیلتر جریان ثابت نصب کنید، صفحه فیلتر را با بافر PBS بالای 54 لیتر بر متر مربع بشویید. پس از پایان شستشو، پمپ پریستالتیک را راه اندازی کنید تا به آرامی مایع را پمپ کند، به آرامی سرعت پمپ را در حدود دبی مورد انتظار تنظیم کنید و مایع را فیلتر کنید. حجم فیلتراسیون، زمان، اختلاف فشار و کدورت را در طول فرآیند فیلتراسیون ثبت کنید. فیلتر برای تشخیص آنتی ژن جمع آوری شد.

 

مزایای فیلتراسیون عمیق

فیلتراسیون سطحی یک فناوری است که ذرات روی سطح مواد فیلتر را برای دستیابی به فیلتراسیون جذب می کند. مکانیسم فیلتر عمدتاً بر اساس اندازه ذرات در غربال سیال است، ذرات بزرگ روی سطح غشای فیلتر به دام می‌افتند. فیلتراسیون عمیق از کانال های داخلی برای رهگیری ذرات و جذب در عمق استفاده می کند. نمودار مقایسه این دو در شکل 1 نشان داده شده است.

محلول غیرفعال شده واکسن تب برفکی از یک سازنده خاص به ترتیب توسط غشای سطحی پلی پروپیلن و صفحه فیلتر عمقی 0.45um از قبل فیلتر شده و سپس توسط فیلتر باکتری کش 0}.2um فیلتر شد. داده های فیلترپذیری در جدول 1 نشان داده شده است.

 

کدورت محلول غیرفعال شده واکسن تب برفکی 77 NTU است. اگر باکتری به طور مستقیم فیلتر شود، تعداد زیادی از قطعات سلولی به ناچار باعث مسدود شدن سریع غشای فیلتر 0.2um می شود که بر انتقال ذرات 146S تأثیر می گذارد. بنابراین، پیش فیلتراسیون قبل از فیلتراسیون باکتری زدایی طراحی شد و دو روش پیش فیلتراسیون فیلتراسیون عمیق و فیلتراسیون سطحی با هم مقایسه شدند. صفحه فیلتر عمیق دولایه برای فیلتراسیون انتخاب شده است، بار 641 L/m2 است و فیلتر عمیق مواد 77 NTU را به 9.65 NTU کاهش می دهد که شفاف و روشن است. بار فیلتراسیون سطحی 0.45um تنها 46 لیتر بر متر مربع است و کدورت مایع فیلتر به 41 NTU می رسد که برای پیش فیلتراسیون مناسب نیست. با توجه به مقایسه بار فیلتر زدایی شده بعدی 0.2um، بار غشای فیلتر زدایی شده پس از فیلتراسیون عمیق 655 لیتر بر متر مربع است که 7.2 برابر بار فیلتراسیون سطحی مربوطه (فقط 91 لیتر بر متر مربع) است. .

نتایج آزمایش 146S نشان می دهد که بازده سیستم فیلتراسیون عمیق بیشتر از سیستم فیلتراسیون سطحی است. بار فیلتراسیون عمیق 13.9 برابر فیلتر سطحی بود، کدورت مایع فیلتر تنها 23.5 درصد از فیلتر سطحی بود، و بار فیلتراسیون حذف کننده باکتری 0.2um 7.2 برابر بار فیلتراسیون سطحی بود. فیلتراسیون سطحی بنابراین، هم از نظر هزینه و هم از نظر بازده، سیستم فیلتراسیون عمیق به طور قابل توجهی بهتر از سیستم فیلتراسیون غشایی سطحی است.

 

مزایای فیلتر عمیق بار مثبت قوی

صفحه فیلتر عمیق بار مثبت و صفحه فیلتر عمیق بار مثبت قوی برای مقایسه محلول غیرفعال واکسن بیماری تب برفکی از منابع مختلف استفاده شد. نتایج فیلترپذیری در جدول 2 نشان داده شده است و تغییر سرعت فیلتراسیون و اختلاف فشار در فرآیند فیلتراسیون در طرح رنگی 2 نشان داده شده است.

دو گروه از صفحات فیلتر عمیق مورد استفاده دارای دقت دیافراگم یکسانی هستند و عملکرد از نقطه نظر تغییر بار و اختلاف فشار بسیار سازگار است و منحنی تغییر اختلاف فشار در شکل 2 اساساً یکسان است.

 

با این حال، از کدورت مایع فیلتر، تفاوت بسیار زیاد است. مایع فیلتر صفحه فیلتر دو لایه معمولی با بار مثبت 25 NTU است، در حالی که مایع فیلتر صفحه فیلتر لایه عمیق با بار مثبت قوی با همان روزنه تنها 9.65 NTU است که تنها 38.6٪ از صفحه فیلتر عمیق معمولی است. این عمدتا به دلیل لیگاند رزینی ویژه در ماده فیلتر صفحه فیلتر عمیق بار مثبت قوی است. کدورت توسط صفحه فیلتر دولایه به شدت مثبت به کمتر از 10NTU کاهش می یابد و قطعات سلولی به طور کامل جذب یا به دام می افتند، که منجر به فرآیند اولترافیلتراسیون یا فیلتراسیون باکتری کش بعدی می شود. علاوه بر اثر جذب روی بقایای سلولی نامحلول، Yigzaw Y و همکاران همچنین اثر حذف صفحه فیلتر عمیق با بار مثبت قوی بر روی پروتئین میزبان سلول را گزارش کرده اند، و Dorsey N و همکاران اثر حذف صفحه فیلتر عمیق با بار مثبت قوی را گزارش کرده اند. روی DNA

 

ایجاد فرآیند فیلتراسیون شفاف برای مایع رویی واکسن تب برفکی با فیلتراسیون عمیق

از طریق مطالعه مقایسه‌ای فیلتراسیون سطحی و فیلتراسیون عمیق، و مطالعه اثر شفاف‌سازی صفحه فیلتر عمیق با بار مثبت قوی ویژه، طرح‌های فیلتراسیون مختلف باید با مایع رویی غیرفعال شده واکسن تب برفکی تولید شده در شرایط مختلف مطابقت داده شود. شرایط فرهنگ برای مایع رویی گریز از مرکز با 3 کدورت مختلف، کدورت کم، کدورت متوسط ​​و کدورت بالا، طرح فیلتراسیون عمیق و پارامترهای فیلتراسیون مربوطه در جدول 3 نشان داده شده است.

برای مایع رویی گریز از مرکز با کدورت کم، صفحه فیلتر عمیق تک لایه می تواند به طور موثر مقدار کمی از بقایای سلولی را شفاف کرده و حذف کند. برای مایع رویی گریز از مرکز با کدورت متوسط، صفحه فیلتر عمیق دو لایه می تواند به طور موثر شفاف شود، به خصوص صفحه فیلتر عمیق بار مثبت قوی می تواند کدورت را به کمتر از 5 NTU کاهش دهد. برای مایع رویی گریز از مرکز با کدورت بالاتر، صفحه فیلتر ترکیبی را می توان به طور موثر شفاف کرد. مهم نیست که کدام فرآیند، ظرفیت پردازش 500 ~ 800 لیتر بر متر مربع است، کدورت مایع فیلتر کمتر از 20 NTU است، و آنتی ژن هدف به طور کامل بازیابی می شود، مناسب برای تولید در مقیاس بزرگ.

 

بحث

در دهه 1970، به دلیل وجود مواد سرطان زا در مواد آزبست، محیط فیلتر مشخص شد که از مواد آزبست استفاده نمی کند. مواد فیلتر عمیق حاوی آزبست نیست و بار مثبت قوی تری دارد. مواد فیلتر از ماتریس فیبر چوب و کمک فیلتر ساخته شده است. در فرآیند تولید، از رزین پلیمری برای اتصال اجزای اصلی استفاده می شود و گروه های عاملی بار مثبت موجود در آن به طور موثر توانایی جذب بار مواد فیلتر عمیق را می دهد. عملکرد عالی فیلتراسیون عمیق جذبی بر روی توانایی جذب ذرات ریز در شکل 3 نشان داده شده است.

در این آزمایش، اجزای مختلف رزین و مواد فیلتر عمیق دقیق مختلف برای شفاف‌سازی تست فیلتراسیون محلول کشت FMDV انتخاب شدند و آزمایش مقایسه با فیلتراسیون سطحی انجام شد. نتایج نشان داد که فیلتراسیون عمیق برای حذف بقایای سلولی مناسب‌تر از فیلتراسیون سطحی بود، که منجر به واحد فیلتراسیون کنترل بار میکروبی بعدی ({0}}.2um) شد. علاوه بر این، با مقایسه اثر فیلتراسیون صفحه فیلتر عمیق بار مثبت قوی و صفحه فیلتر عمیق بار مثبت معمولی، صفحه فیلتر بار مثبت قوی توانایی کنترل کدورت قوی را نشان می‌دهد که می‌تواند کدورت را به کمتر از 5 NTU کاهش دهد. برای بهبود استحکام کل فرآیند فیلتراسیون بسیار مفید است.

فرآیند کشت بالادست تأثیر زیادی بر مراحل برداشت مواد فعال دارد. از طریق آزمایش، این آزمایش در نهایت یک طرح فیلتراسیون مقیاس‌پذیر برای محیط‌های کشت سلولی با کدورت‌های مختلف ایجاد کرد که اهمیت هدایت‌کننده خاصی برای تولید در مقیاس بزرگ دارد.

فیلتر عمقی که توسط Guidling Technology راه اندازی می شود یک عنصر فیلتر از نوع دیسکی است که نوعی عنصر فیلتر کارآمد با مقوای فیلتر عمیق به عنوان ماده فیلتر است که به طور کامل الزامات نظارتی داروسازی زیستی را برآورده می کند که عمدتاً به طور خاص برای حذف مواد طراحی و ساخته شده است. محتویات جامد بزرگ مانند سلول ها و قطعات سلولی، و می تواند به مایع کشت سلولی پستانداران اعمال شود. شفاف سازی لیز باکتری ها و سلول های مخمر؛ حذف پروتئین سلول میزبان (HCP)؛ ویروس و DN را حذف کنید. حذف اندوتوکسین ها؛ حذف کف زدا.

این محصول دارای مزایای حجم مرده کوچک، تقویت خطی، ساختار کپسول دیسک، طراحی ساختار جمع و جور است و می تواند به صورت سری با سایر تجهیزات، ردپای کوچک، سرعت جریان پایدار، عمر طولانی و هزینه کم استفاده شود.